农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。

二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。

农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。

土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。

这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。

三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。

2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。

或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。

农杆菌的浸染实验的注意事项《农杆菌的浸染实验的注意事项》农杆菌浸染实验就像是一场微观世界里的“细菌特工潜入行动”，每个环节都需要我们精心操作，稍有差池就可能让整个“任务”失败。

下面就来详细说说这个实验中的注意事项。

一、实验材料准备阶段1. 植物材料的选择- 这就好比是选演员，要选对主角。

植物材料要健康、生长状态良好。

如果植物本身就病恹恹的，那农杆菌这个“小特工”可能都找不到合适的“潜入点”。

比如，你不能拿已经快被虫子吃光叶子的植物来做实验，就像你不能让一个瘸腿的运动员去参加百米赛跑一样。

要选择幼嫩的组织，像是刚萌发的叶片或者嫩茎等，这些部位细胞分裂活跃，更容易被农杆菌感染，就像年轻的士兵更容易接受新的训练任务一样。

2. 农杆菌菌株的保存与活化- 农杆菌菌株就像是我们的特种部队，保存的时候一定要小心翼翼。

要在合适的温度（通常是 - 80℃或者液氮中）保存，这就好比是把特种部队放在一个安全的秘密基地里。

活化的时候，要严格按照操作规程，在合适的培养基上，给予恰当的营养成分，就像是给士兵们提供充足的食物和装备一样。

如果活化不当，农杆菌的活性就会大打折扣，就像士兵们饿着肚子、没带武器就去执行任务，肯定是不行的。

二、浸染过程中的注意要点1. 浸染液的制备- 浸染液里农杆菌的浓度可是个关键因素。

浓度太低，就像派出的特工人数太少，难以完成对植物细胞的“攻占”；浓度太高呢，又可能会把植物细胞“撑坏”，就像一群人挤在一个小房间里，结果谁都动弹不得。

一般要通过预实验来确定最佳的农杆菌浓度。

而且，浸染液里还可能需要添加一些辅助物质，比如乙酰丁香酮，它就像是给农杆菌特工们的“导航仪”，帮助农杆菌更好地找到植物细胞并进行浸染。

2. 浸染时间的控制- 浸染时间就像是一场限时的魔术表演。

时间太短，农杆菌还没来得及大展身手，就被赶出了植物细胞的“城堡”；时间太长呢，植物细胞可能会被农杆菌折腾得“奄奄一息”。

不同的植物材料和农杆菌菌株可能需要不同的浸染时间，这就需要我们不断地摸索，就像魔术师要不断练习才能掌握最佳的表演时长一样。

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。

固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。

卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。

一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。

二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。

农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。

二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。

转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。

检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。

（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。

农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的细菌，它引起了许多植物疾病，并广泛应用于植物基因转化和构建转基因植物。

农杆菌感染的方式分为两个主要步骤：附着和转化。

首先，农杆菌通过其特殊的附着鞭毛附着在植物细胞的表面。

这些附着鞭毛具有与植物表面组织相互作用的能力，帮助菌体在细胞壁上定位。

然后，农杆菌进一步通过组成细菌群体的多聚糖特异性识别植物细胞并贴附在其表面。

这个过程涉及的多聚糖是菌体外表面中的一种多糖物质，称为Beta-1,2-葡聚糖。

该多糖与植物细胞表面的特定受体结合，使细菌固定在植物细胞表面。

接下来，农杆菌通过化学信号释放细菌表面小分子信号物质，称为诱导物质。

这些诱导物质与植物细胞的感受器相互作用，诱导植物细胞启动反响。

在感染过程中，农杆菌释放的Ti质粒在接触植物表面后激活，融入植物细胞胞质。

这个过程主要涉及到Ti质粒上的一些基因区域，称为过渡区，它负责将外源基因转移到植物细胞中。

接下来，T DNA被运送到植物细胞的细胞核中。

T DNA的传输过程主要受T基因（vir基因）的操控，这些基因编码用于T DNA传输的蛋白质。

一旦T DNA被引入细胞核，它会被整合到植物细胞的基因组中，并在细胞分裂过程中通过传代进行稳定遗传。

这个过程涉及到转座酶（T nase）等蛋白质的参与，它们帮助将T DNA插入植物基因组的特定区域。

总之，农杆菌侵染烟草的原理涉及一系列复杂的分子交互作用和基因调控过程。

通过附着、感染、引入TDNA以及其整合到植物基因组中，农杆菌成功地将外源基因引入烟草细胞，并构建转基因烟草。

这为基因工程研究和转基因植物生产提供了重要的工具和方法。

烟草实验实训目的和要求
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。

本实验以烟草为实验材料，使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。

烟草叶片，LBA4404质粒载体，摇床，培养皿（带滤纸），移液枪，镊子，手术刀，无菌水。

根癌农杆菌介导转化的方法已经比较成熟，易于在植物细胞和组织培养实验室进行。

具体操作程序如下：
（1）根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在YEP固体培养基上，YEP固体培养基的成分为每100mL含NaCl 0.5g，酵母1 g，水解酪蛋白1g，琼脂1.5g，pH值7.0，在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。

（2）配制YEP液体培养基：成分同上，只是不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5mL左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。

（3）摇菌：用灭菌后的牙签或者火柴棍等挑出一些菌液，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于振荡器上摇菌16—17h（180r ／min），直至溶液变浑浊，即有大量菌丝长出。

（4）用消毒后的0.5mm打孔器从叶片上切出叶盘，然后将叶盘投入农杆菌悬液中培养5min。

（5）用滤纸吸干多余的菌液，叶片放在MS+6—BA 1.0 mg/L 十IAA 0.1 mg/L培养基上共培养2d，随后转至附加卡那霉素
100mg/L，羧苄青霉素500 mg/L的培养基上筛选培养，（25±1）℃，16h光周期。

（6）2周后分化出卡那霉素抗性芽（应为绿色），从基部将芽切下，转至含100mg/L卡那霉素和500 mg/L羧苄青霉素的MS+0.1 mg/LIAA上生根培养，生根后的植株移入温室内栽培。

农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤整理人：早熟组赵凤利一、准备试剂：1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。

1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃2). 20 mM Na3PO4·12H2O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20℃。

二、实验步骤：1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。

6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。

7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11.侵染前，用记号笔标记待转区域；12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14.将侵染后的烟草放回培养室15.2-3天后：1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。

植物材料：Nicotiana benthamiana
菌种：GV3101
载体：Cam35S-gfp
第一天：
准备菌液，Culture a single colony in liquid LB + 50 mg/L Kanamycin + 60 mg/L Gentamicin
第三天：
转化
准备植物材料
1.无菌烟草材料，生长4-5周，完全展开叶片；
2.切成0.6cm到0.8cm见方叶盘；
3.用重悬液RM重悬离心收集的农杆菌菌体（2500 g，5 min），重悬至OD600=0.5~0.8；
4.将叶盘转入农杆菌重悬液中，28℃侵染30 min；
5.倒掉农杆菌菌液，将叶盘转到固体RM培养基上，覆盖无菌滤纸。

共培养：
在黑暗中25℃培养3天。

洗涤：
共培养后，将叶盘转到一个50ml圆底离心管中，用含有1000 mg/L特美丁RM溶液洗涤3 min，用RM溶液洗两次，每次3分钟。

筛选和分化培养：
1.用滤纸将叶盘表面吸干；
2.将叶盘放置到筛选RM培养基，10个叶盘一个皿；
3.黑暗中培养2周，转移至光下培养；
4.每3周继代一次。

生根
1.将分化愈伤转移至生根培养基；
2.成苗。

RM培养基：（固体加8 g/L Agar）
MS盐
B5 Vitamins
30 g/L 蔗糖
BA 2.0 mg/L
NAA 0.2 mg/L
PH 5.6
筛选培养基：
除上述成分外，加特美丁终浓度300 mg/L，潮霉素50 mg/L。