菌种传代记录表

细菌传代操作规程细菌传代操作规程引言：细菌传代是一种实验室技术，用于研究细菌在连续传代中的生物学特性和遗传变异。

正确的传代操作是维持细菌群体稳定且准确反映遗传特性的关键。

为了保证传代操作的成功和规范性，制定相关的操作规程是必要的。

一、实验前准备：1. 确定传代实验的目标和方案。

2. 准备所需的培养基、试剂和实验器材。

3. 检查实验器材的清洁和消毒情况，保证无污染。

二、细菌传代操作步骤：1. 第一代接种：a. 从冷冻细菌库中取出所需的细菌母种，转接到含有适当培养基的培养皿中。

b. 用接种环或接种针沾取适量的细菌悬液，均匀涂布在培养皿的表面。

c. 恒温培养箱中培养，温度和时间根据不同的菌株而定。

2. 后续代接种：a. 从前一代的培养皿中取适量的细菌悬液，转接到新的培养皿中。

注意保持接种量的一致性。

b. 重复上述步骤，逐代传代。

三、传代操作注意事项：1. 操作均需在无菌工作台或无菌条件下进行，以避免外源性污染。

2. 接种时避免直接接触培养基和装置内壁，以减少细菌的外源污染。

3. 接种环或接种针在使用前需经过高温炉高温灼烧，以杀灭潜在的细菌。

4. 尽量避免细菌的暴露在空气中的时间过长，以保证其活力。

5. 传代时应注意接种量的一致性，以减少菌群的变异。

四、细菌传代操作记录：1. 每次操作均需详细记录传代实验的日期、细菌菌株、传代代数等信息。

2. 记录每次传代的细菌生长情况，如菌落形态、数量等。

3. 定期保存样品用于后续的分析和验证。

五、实验后处理：1. 做好实验区域的清理和消毒，防止细菌污染蔓延。

2. 注射器、接种环和接种针等实验器材彻底清洗和高温灼烧。

3. 储存冷冻细菌库中的细菌母种。

六、应急措施：1. 若在实验过程中出现异常情况，如培养皿内出现异常菌落、污染等，应立即停止传代操作，并采取必要的消毒措施。

2. 若实验结果与预期不符，可重新设计实验方案或检查实验操作是否存在问题。

结语：细菌传代操作规程旨在规范实验操作过程，确保细菌传代的准确性和连续性。

菌种传代与复苏菌种传代与复苏（实操）一、菌种传代与复苏1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。

1.2 菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)980031.3 传代和接种1.3.1 菌种冻干粉复苏1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。

1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。

1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。

1.3.2菌种斜面传代操作1.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。

标签上注明菌种名及菌种编号。

至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

1.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。

菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。

3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。

4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。

5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。

5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。

保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。

3、定义标准菌株是指由XXX提供的冷冻干燥菌。

传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第代。

4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、储存分发。

4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向XXX菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。

5.2菌种的接收5.3菌种的储存5.3.1工作用菌种的储存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。

保存时间根据菌种种类而1不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每一年转种一次。

5.3.2传代用菌种的保存采用甘油冷冻管收藏法或液体石蜡储存法。

5.3.2.1甘油冷冻管储存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。

检定用菌种、传代、贮存、接种操作细则传代与接种操作步骤：1、先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。

2、再将菌种管（即原有的菌种斜面培养基）与待接种的新鲜斜面培养基（接种管）持在左手拇指、食指与中指之间，要注意能清楚的观察到斜面，菌种管在前、接种管在后，应斜持试管显45℃角，使试管内斜面上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免底管凝聚小浸湿培养基表面。

3、用右手将两管棉塞转动，以便接种时易于拔取。

再灼烧接种环注意灼烧时，接种环应垂直或稍斜的在外焰上灼烧，外焰温度与内焰高，顶端的环必须烧红，以彻底灭菌，环以上进入试管部分也应充分通过火焰灭菌。

4、使用右手小指与无名指及无名指中指之间，在火焰旁分别拔下两只试管的棉塞、持住，将试管口通过火焰，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。

5、将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触无军生长的培养基快速冷却，若接触的培养基有熔印时则表明接种环未冷却，能烫死细胞。

待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，在火焰旁边，迅速踌躇接种环伸入接种管，在管内斜面上划线接种。

划线时在斜面上应先由内向外划一直线后，再由内向外划曲线。

*注意事项：1、整个操作过程应迅速且在酒精灯上方操作，勿使菌苔沾至管壁或管口。

2、从菌种管取出少量菌种苔后接种环，切不可通过火焰，以免菌种被烧死，也不宜火焰太远。

（避免污染）3、接种完毕后，立即在火焰旁塞上棉塞，再将接种环灼烧灭菌放回原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可置适宜温度培养。

4、操作过程中，若棉塞不慎触及火焰而着火，切忌用口吹，若是棉塞进试管塞内一端着火，可在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不是会很快熄灭，若棉塞外着火，可用手捏熄，若棉烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基的灭菌棉塞，代替塞上。

5、借重完毕，应做好记录。

菌种的分离鉴别操作细则目的：当菌种污染某菌时，可将菌种接种于平板培养基进行分离，再根据菌种形态，挑取典型纯菌落并鉴别制成菌种管。

分离方法及步骤：1、取已污染某菌的菌落管，左手拿着菌种管拧松棉塞。

4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。

4.2 菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)980034.3 传代和接种4.3.1 菌种冻干粉复苏4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。

4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。

4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。

4.3.2菌种斜面传代操作4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。

标签上注明菌种名及菌种编号。

至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。

菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。

菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003传代和接种菌种冻干粉复苏把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。

先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。

取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。

菌种斜面传代操作培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。

标签上注明菌种名及菌种编号。

至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。

左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。

之迟辟智美创作4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本资料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与收藏是一项重要的基础工作.4.2 菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种收藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌.金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003年夜肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)980034.3 传代和接种4.3.1 菌种冻干粉复苏4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台.4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干.扑灭酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂.4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口翻开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养.4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用.标签上注明菌种名及菌种编号.至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台.4.3.2.2扑灭酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部份在火焰上烧灼，往返通过3次.左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁.4.3.2.3堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述把持翻开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的概况曲折移动，使细菌划在斜面的概况上.4.3.2.4取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌.4.4菌种的培养与保管4.4.1 年夜肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天4.4.2 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保管，一般2个月转种一次. 4.5 菌悬液的制备4.5.1 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用.一般于冰箱中保管可用两周.4.5.2 取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只刻度吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中混匀，为10-2......以此类推，稀释至含活菌数在50-100个.用平板计数.4.5.3 此稀释菌液用于试验后加阳性对比，可在一周内使用.4.7 记录 4.7.1 传代和接种使用后，应做好《菌种传代接种记录》.4.7.2 菌悬液制备后，应做好《菌液制备使用记录》.依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种收藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部份已接种好的菌种斜面（3代）.黑曲霉的0代菌种为保管于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的胞子悬液冷存管.中国药品生物制品检定所医学微生物菌种收藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号.从菌种收藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料.接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性.在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等.在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至.新购入的0代原始菌种贮存于－20℃，有效期为三年.从上级药检部份购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好.贮存于2～8 ℃，有效期为3个月.3. 标准菌的复苏、复壮及标准储藏菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、年夜肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮.改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3把持步伐：a.翻开洁净工作台.b.在安瓿的外概况用75%的酒精擦拭并让其自然风干.c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必需小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）.d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中.e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充沛混合并完全溶解.f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基.g.根据安瓿上所标明的分歧菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天.观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处置.h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面正面无色，接近菌层培养基略带黄色.确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中.i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项把持对菌种进行复壮.以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管.每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应简直认.其余作为储藏管.黑曲霉的h 项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的胞子悬液20ml.以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管.制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应简直认.其余作为储藏管.将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签.内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等.j．储藏菌种管制备胜利，贮存于－20℃，有效期为三年.用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落.然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征.假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或把持有污染或菌种不纯.将此被污染了的培养物灭菌处置.可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代.偏重新制备储藏菌种管将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种收藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种.菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超越5代.菌种的传代收藏过程3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代. 传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种.此时，工作用菌种为第3代.工作用菌种，分为两类：一类用于按期传代(W3)，一类用于实验用（S3）.按期传代用菌的传代其把持步伐如下（斜面接种法）：（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟.（2）将装有新鲜配制的培养基菌种收藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，翻开紫外灯照射一小时.（3）关闭紫外灯.扑灭酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部份在火焰上烧灼，往返通过三次.（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方.（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述把持翻开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的概况上.（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌.（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天.当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）.按上述法式把持，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁.菌种斜面的培养、收藏条件及时间注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常.每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种.如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌.每次把持，都应进行记录.菌种管上应贴有牢固的标签.标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等.废弃菌种及实验用品废弃物的处置：121℃高压蒸汽灭菌30分钟.并对把持过程进行记录.。