菌种传代与保藏

菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。

很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。

2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。

保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。

3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。

我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。

4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。

在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。

保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。

5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。

液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。

菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。

2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。

接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。

在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。

储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。

3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。

e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。

g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。

观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。

菌种传代与保藏作业指导书1、标准菌得来源标准菌株必须购买具备资质得菌种保藏中心提供得冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。

2、标准菌得验收从菌种保藏中心购买得原始菌种管就是玻璃安瓿装得冻干菌，接收同时应检查就是否有随菌种附有得相关资料。

接收菌种时应检查安瓿得数量与名称，与每一支安瓿得完整性。

在相应得菌种接收记录上记上所有得关于菌种得信息，如名称、数量与接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入得0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

购买得已接种好得菌种斜面（3代）应检查菌种管就是否完好。

储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。

3、标准菌得复苏、复壮及标准储备菌株得制备3、1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3、2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮、营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3、3操作步骤：a、打开洁净工作台。

b、在安瓿得外表面用75%得酒精擦拭并让其自然风干。

c、用一小砂轮在安瓿得上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d、以无菌方法用一无菌吸管从已准备好得上述液体培养基中移取0、5～0、8 ml到安瓿中。

e、轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种与液体培养基充分混合并完全溶解。

f、用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应得液体培养基。

g、根据安瓿上所标明得不同菌种类型而将其培养于相应得温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。

观察就是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h、取经复苏后得上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。

菌种代号的意义、菌种传代与保存方法汇总一、菌种代号的意义国内常见微生物检验所用的菌种代号是：C MC C（F）或C MC C（B）C MC C—中国医学菌种保藏中心B—代表细菌， F —代表真菌。

大肠杆菌[C M C C(B)44102]；乙型副伤寒沙门杆菌[C M C C(B) 50094]；铜绿假单胞菌 [C M C C(B)10104]；金黄色葡萄球菌 [C M C C (B)26003]；生孢梭菌[C M C C(B)64941]；白色念珠菌[C M C C(F)98001]。

二、常用菌种保藏方法(一) 菌种保藏的原理根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。

低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。

低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。

选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。

在实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏效果。

（二）菌种保藏步骤①挑选特征典型的纯菌菌落；②确定保藏的合适菌体形态；③选择最适宜的保藏方法；④定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。

保藏期满应及时进行移种。

1、琼脂斜面低温保存法（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。

放在4℃左右的冰箱中保藏。

每隔2~3个月移种一次，继续进行保藏。

若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年~ 一年。

有的甚至更长时间。

（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。

（3）特点：优点是：简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用；缺点是：保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。

菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。

2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。

接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。

在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。

储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。

3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml 到安瓿中。

e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。

g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。

观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。

菌种保存⽅法-菌种保存⽅法：⼀.菌种保藏⽅法⼤致可分为以下⼏种：1．传代培养保藏法⼜有斜⾯培养、穿刺培养、疱⾁培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌⽤），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体⽯蜡覆盖保藏法是传代培养的变相⽅法，能够适当延长保藏时间，它是在斜⾯培养物和穿刺培养物上⾯覆盖灭菌的液体⽯蜡，⼀⽅⾯可防⽌因培养基⽔分蒸发⽽引起菌种死亡，另⼀⽅⾯可阻⽌氧⽓进⼊，以减弱代谢作⽤。

3．载体保藏法是将微⽣物吸附在适当的载体，如⼟壤、沙⼦、硅胶、滤纸上，⽽后进⾏⼲燥的保藏法，例如沙⼟保藏法和滤纸保藏法应⽤相当⼴泛。

4．寄主保藏法⽤于⽬前尚不能在⼈⼯培养基上⽣长的微⽣物，如病毒、⽴克次⽒体、螺旋体等，它们必须在⽣活的动物、昆⾍、鸡胚内感染并传代，此法相当于⼀般微⽣物的传代培养保藏法。

病毒等微⽣物亦可⽤其他⽅法如液氮保藏法与冷冻⼲燥保藏法进⾏保藏。

5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、⼲冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

常⽤的有⽢油菌保存：取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%⽢油的加⼊量，保存零下80度。

例：取37°培养过夜的菌液2-4ml⽢油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。

6．冷冻⼲燥保藏法先使微⽣物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利⽤升华现象除去⽔分（真空⼲燥）。

有些⽅法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻⼲燥保藏法等均需使⽤保护剂来制备细胞悬液，以防⽌因冷冻或⽔分不断升华对细胞的损害。

保护性溶质可通过氢和离⼦键对⽔和细胞所产⽣的亲和⼒来稳定细胞成分的构型。

保护剂有⽜乳、⾎清、糖类、⽢油、⼆甲亚砜等。

⼆.常⽤的器材所要保存的微⽣物；⾁膏蛋⽩胨斜⾯培养基，灭菌脱脂⽜乳，灭菌⽔，化学纯的液体⽯蜡，⽢油，五氧化⼆磷，河沙，瘦黄⼟或红⼟，冰块、⾷盐，⼲冰，95％酒精，10％盐酸，⽆⽔氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养⽫，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40⽬与100⽬筛⼦，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），⼲燥器，真空泵，真空压⼒表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。

菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。

2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。

接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。

在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。

在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。

新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。

储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。

3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。

e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。

g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。

观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。