菌种的复苏传代及保存标准程序.

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程.菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。

3、定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。

4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。

5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。

5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。

保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。

每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。

每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。

复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。

5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。

使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。

5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。

菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。

菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。

5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。

5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。

5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。

传代次数不宜过多，一般不超过10代。

几种菌种的保存及复方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。

菌种复苏传代保存操作规程菌种复苏传代保存是微生物实验室中常见的操作之一，其目的是将冷冻保存的菌种从冷冻状态中恢复出来，并按照一定的方法传代保存。

以下是菌种复苏传代保存操作规程，共1200字。

一、实验准备1.1 准备所需物资：包括菌种冻存试管、培养基、称量仪器、吸管、移液器、贴标纸等。

1.2 检查完整的实验设备：包括洁净台、离心机、培养箱、移液枪等，确保设备无损坏。

1.3 检查所需培养基的质量：检查培养基的配制日期、有效期等，确保培养基适用于所需菌种。

二、复苏菌种2.1 取出含菌种的冻存试管：从冷冻保存箱中取出所需菌种的冻存试管，并将试管放置于洁净台上。

2.2 快速复苏：将冻存试管置于培养基底部，用力旋转数次，使菌种快速复苏。

2.3 开孔放气：用火焰消毒后的吸管尖端取出菌种后将其放入含菌种的冻存试管中，并迅速封闭试管口，以防菌种污染。

2.4 培养基选择：根据菌种类型的不同，选择相应的培养基进行培养。

如需选择无菌培养基时，需要在使用前先进行灭菌处理。

2.5 培养条件：将含菌种的试管放入预先灭菌处理过的培养基中，确保培养基将菌种完全覆盖，并在适当的培养条件下培养，包括温度、湿度、光照等。

三、传代保存3.1 菌种鉴定与纯化：复苏后的菌种应进行鉴定与纯化，以确保菌种的纯度和正确性。

3.2 菌种传代：将复苏后的菌种接种到新的培养基中，进行传代培养。

传代时应注意传代次数，一般不超过10次。

3.3 传代培养条件：传代时应保持相同的培养条件，以保证菌种的生长状态和性状的稳定。

3.4 保存方式选择：根据菌种的特性和实验需求，选择适当的保存方式，包括持续传代培养、冷冻保存、冷冻干燥等。

3.5 标识和记录：每次传代后，应及时贴标记于保存容器上，并记录传代时间、次数和相关信息，以便后续使用和管理。

四、实验安全与废弃物处理4.1 实验环境安全：在进行菌种复苏传代保存操作时，应注意实验室的环境安全，保持实验室干净、整洁，并严格遵守实验室操作规范。

菌种复苏传代操作规程一、背景介绍菌种复苏传代操作是微生物实验室中常见的实验操作之一。

通过复苏并传代菌种，能够恢复其活性并扩大其数量，为后续的实验研究提供足够的菌种量。

本文将对菌种复苏传代操作进行详细的介绍和规程。

二、菌种复苏1.准备工作–检查实验室条件：确保工作台面、培养箱和工具的清洁程度，防止交叉污染。

–准备所需培养基：根据菌种类型选择合适的培养基，如琼脂培养基、液体培养基等，并按照要求配制。

–检查试剂：检查培养基和其他试剂的质量和保存情况，确保使用的试剂没有变质。

–备注标签：为每个培养皿或试管添加标签，标明菌种名称、菌株编号和日期等信息。

2.菌种复苏步骤–从冷冻细胞库中选择合适的冻存物：确保选择与实验目的一致的菌种冻存物进行复苏。

–快速复苏：将冻存物迅速取出，放在含有适量温和培养基的试管中，轻轻摇匀。

–孵育：将试管置于适当的温度和湿度条件下，进行孵育。

通常温度为30°C，孵育时间根据菌种不同而异，一般为24-48小时。

–观察生长情况：观察菌种的生长情况，包括菌落数量和形态特征等。

确认菌种是否成功复苏。

三、菌种传代1.准备工作–准备培养基和试剂：根据菌种特性选择合适的培养基，并按照要求配制好。

–准备培养皿或试管：确保培养皿或试管干净，不含任何污染。

–注射器和接种环的消毒：使用75%乙醇对注射器和接种环进行消毒处理，避免交叉感染。

2.菌种传代步骤–挑取菌落：使用消毒过的注射器，挑取菌落，并迅速划线于新的培养皿或试管中。

–均匀接种：使用消毒过的接种环，将菌落均匀划线于培养皿或试管表面。

–孵育：培养皿或试管置于适当的温湿度条件下，进行孵育。

温度和孵育时间根据菌种特性而异，需根据实验需求进行调整。

–观察生长情况：观察菌种的生长情况，如菌落数量、形态特征和菌落色泽等。

四、菌种传代操作注意事项1.严格消毒–操作前要进行充分的手部卫生和工作台面的消毒。

–使用消毒过的工具，如注射器、接种环等，避免交叉感染。

菌种传代、使用、保存操作规程1.目的本文件规定了微生物检验用菌、无菌检验用菌及抗生素检验用菌的接种、保存，传代方法及要求，适用于中心化验室进行检验用菌的接种和传代操作。

2. 适用范围适用于中心化验室菌种管理人员进行检验用菌的接种、保存和传代操作。

3.职责菌种管理人员应按本程序的规定操作。

4.参考文件及相关程序B08(02)005 微生物实验室标准管理程序B08(02)019 微生物检验用菌标准管理程序B08(02)020 检验用培养基标准管理程序5. 程序5.1.对照菌株名称·金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕·铜绿假单胞菌〔CMCC(B) 10 104〕·生孢梭菌〔CMCC(B) 64 941〕·枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 501〕·大肠埃希菌〔CMCC(B) 44 102〕·白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕·黑曲霉〔CMCC(F) 98 003〕·短小芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 202〕·藤黄微球菌〔CMCC(B) 28 001〕·乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B) 50 094〕5.2.菌种来源中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥菌种（即安瓿）。

5.3. 微生物检验用菌菌悬液的制备5.3.1.菌种的复苏与传代5.3.1.1. 取备妥的冷冻菌种安瓿，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、灭菌水及复苏菌种所需的培养基等物品，移入超净工作台。

5.3.1.2. 用75%酒精棉球擦净冷冻菌种安瓿外壁，放在灭菌双碟内，待干。

5.3.1.3. 点燃酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼，用灭菌毛细管吸取灭菌水或胰酪大豆胨液体培养基少许在灼热处，使其骤冷,用干燥无菌纱布包裹安瓿，安瓿掰开。

5.3.1.4. 在不离开火焰圈内，迅速用注射器抽取约0.5ml胰酪大豆胨琼液体培养基，注入安瓿内，轻轻震摇使冷冻菌块溶解、混匀，随即用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支胰酪大豆胨液体培养基，1支普通胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面培养基内。

菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。

范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。

职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。

内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。

操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。

1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。

使用前需将其复苏。

1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。

②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。

③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。

1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。

1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。

1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。

1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。

用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。

1.1.2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。

如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。

菌种得复苏传代及保存标准程序目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。

内容:菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。

１.菌种得复苏1.1冻干菌种得复苏检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。

使用前需将其复苏。

1．１.１准备:①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。

②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。

③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。

1.１。

2操作:1。

1。

２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、1.1.2。

2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。

1.1。

2。

3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。

１．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

1．1。

2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

1.1。

2。

6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。

１。

1.2。

7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。

如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。

１、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种斜面接种点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。

稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。

适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。

密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。

菌种管理制度1、目得建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程,规范微生物学检定用菌种得管理,最大限度降低变异率,确保菌种得溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果得准确可靠。

2、适用范围本规程适用于检定用菌种得管理,包括菌种得购买、保存、传代、使用及销毁等。

3、定义➢标准菌株就是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供得冷冻干燥菌。

➢传代用菌种就是指用标准菌株制备得采用特定保存方法长期固定保存得菌种,用于传代及制备工作用菌种。

➢工作用菌种就是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用得菌种。

➢菌种得代就是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得得冷冻干燥菌种为第0代。

4、职责4、1部门主管负责菌种得申购、接收、保存分发。

4、2微生物检验员负责菌种得确认、传代、使用及销毁。

5、规程5、1菌种得申购部门主管根据菌种得使用情况,提出年度购买计划(包括临时检验需要),填写申购流程,经审批后,向中检所菌种保藏中心或省(市)药检所购买冻干菌种(标准菌株)或传代用菌种,购买时,需确定菌种得代数,以便控制传代代数。

5、2菌种得接收菌种到达实验室后,由部门主管接收菌种,检查其名称与数量,以及每一支得完整性,同时将菌种得所有信息,填写在《标准菌株库存记录》上,内容包括:名称、数量、编号(无编号者按检定菌种得编号原则编号)、代数、来源、接收日期、接收人等,并将其暂贮存于4～8℃冰箱中,在一周内必须完成转种。

5、3菌种得保存5、3、1工作用菌种得保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜得琼脂斜面培养基上,待菌生长充分以后,转移至4～8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种得短期保存,并应随时检查其污染杂菌与变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。

保存时间根据菌种种类而不同,细菌:每个月转种一次;酵母菌及芽胞:3~6个月转种一次;丝状真菌每年转种一次。

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种斜面接种点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。

稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。

适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。

密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。

1 目的规范微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2 适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。

3 术语3.1 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

3.2 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

3.3 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

3.4 菌种的传代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4 职责4.1 品管部主管负责菌种的申购、接收、保存、分发。

4.2 微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5内容5.1冻干菌种的复苏菌种复苏、接种在超净工作台内按无菌操作要求进行。

准备好菌种安瓿管（安瓿管从冰箱取出后首先置室温30分钟）、灭菌的毛细滴管、培养皿、镊子、1ml注射器（配有长针头）、营养肉汤培养基、灭菌水及琼脂斜面，将以上物品移入菌种室，用75%乙醇棉球擦净安瓿管外壁放在无菌培养皿内晾干，点燃酒精灯，将安瓿管的封口一端在火焰烧灼红热，用毛细管吸取灭菌水少许滴在灼热处，使其骤冷而炸裂。

在不离开火焰圈内，迅速用1ml注射器抽取0.3ml肉汤培养基加入安瓿管内并摇动使冷冻块溶解，摇匀。

用注射器吸取该安瓿管中内溶物分别接种至1支肉汤培养基、2支琼脂斜面培养基。

将接种后的肉汤及培养基斜面根据菌种特性分别置于菌种相适宜的温度培养，培养完毕，取出培养物，用无菌接种环蘸取少许肉汤培养物，然后在平皿接种处进行划线使其形成单菌落，根据菌种特性分别置于适宜的温度下培养18-24小时，进行革兰染色镜检及相应的生化试验或采用细菌鉴定条对其进行确认。

如不符合要求，应及时与生产商联系。

5.2菌种传代5.2.1准备准备需用的培养基斜面，在培养基管上贴注牢固的标签，标签上注明菌名及接种日期。

几种菌种的保存及复苏方法几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。

范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。

职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。

内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。

操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。

1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。

使用前需将其复苏。

1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。

②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。

③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。

1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。

1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。

1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。

1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。

用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。

1.1.2.7取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。

如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

1.2为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。

205菌种复苏、传代、保存、使⽤、销毁标准操作规程1 ⽬的规范微⽣物学检定⽤菌的管理，最⼤限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从⽽确保微⽣物学检验结果的准确可靠。

2 适⽤范围本规程适⽤于检定⽤菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使⽤及销毁等。

3 术语3.1 标准菌种是指由中国药品⽣物制品检定所医学微⽣物菌种保藏管理中⼼提供的冷冻⼲燥菌。

3.2 传代⽤菌种是指⽤标准菌种制备的采⽤特定保存⽅法长期固定保存的菌种，⽤于传代及制备⼯作⽤菌种。

3.3 ⼯作⽤菌种是指⽤标准菌种或传代⽤菌种接种⾄普通琼脂斜⾯培养后，作为⽇常⼯作使⽤的菌种。

3.4 菌种的传代是指将其接种⾄⼀新鲜培养基上或培养基内，每萌发⼀次即称为⼀代，从菌种保藏中⼼获得的冷冻⼲燥菌种为第0代。

4 职责4.1 品管部主管负责菌种的申购、接收、保存、分发。

4.2 微⽣物检验员负责菌种的确认、传代、使⽤及销毁。

5内容5.1冻⼲菌种的复苏菌种复苏、接种在超净⼯作台内按⽆菌操作要求进⾏。

准备好菌种安瓿管（安瓿管从冰箱取出后⾸先置室温30分钟）、灭菌的⽑细滴管、培养⽫、镊⼦、1ml注射器（配有长针头）、营养⾁汤培养基、灭菌⽔及琼脂斜⾯，将以上物品移⼊菌种室，⽤75%⼄醇棉球擦净安瓿管外壁放在⽆菌培养⽫内晾⼲，点燃酒精灯，将安瓿管的封⼝⼀端在⽕焰烧灼红热，⽤⽑细管吸取灭菌⽔少许滴在灼热处，使其骤冷⽽炸裂。

在不离开⽕焰圈内，迅速⽤1ml注射器抽取0.3ml⾁汤培养基加⼊安瓿管内并摇动使冷冻块溶解，摇匀。

⽤注射器吸取该安瓿管中内溶物分别接种⾄1⽀⾁汤培养基、2⽀琼脂斜⾯培养基。

将接种后的⾁汤及培养基斜⾯根据菌种特性分别置于菌种相适宜的温度培养，培养完毕，取出培养物，⽤⽆菌接种环蘸取少许⾁汤培养物，然后在平⽫接种处进⾏划线使其形成单菌落，根据菌种特性分别置于适宜的温度下培养18-24⼩时，进⾏⾰兰染⾊镜检及相应的⽣化试验或采⽤细菌鉴定条对其进⾏确认。

如不符合要求，应及时与⽣产商联系。

难打破。 3． 3． 4 建立健全社会保障制度
3． 3． 2 建立岗位管理制度 事业单位内部岗位设置的科学合理，每个岗位的职责、
权利和任职条件明确，岗位与岗位之间的关系明确，是确保 事业单位运行顺畅的组织保证。岗位管理制度就是把明确 的岗位设置与人事管理结合起来，使每个人适得其所，保证 事业运行的高效率。岗位不同，管理制度也不一样。建立岗 位管理制度，就是要根据不同的岗位，建立与之相适应的确 保工作人员完成岗位所要求的权责利的制度。 3． 3． 3 建立聘用人员考核制度
Abstract： Through laboratory actual operations and data，I established a process of strains ＇recovery，saving and passage， making strains related operations more specification． Key words： strains＇ recovery； passage； saving
将需要保藏的菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，适 温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出。配制 30% 的甘油 溶液进行 121℃ 下高压灭菌 30min，将生长良好的斜面菌种 用生理盐水制成菌悬液，菌浓度控制在 107 左右，然后加入 等体积甘油水溶液混匀后制成 15% 的甘油菌悬液。 4． 4． 2 分装菌悬液
1 用具与设备
接种环，接种针，酒精灯，电热恒温培养箱，生化培养箱， 冰箱，灭菌柜，超净台，液氮罐，超低温冰箱，1． 5 mL 冻存管， 试管等。
2 菌种的复活
应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 级的单 向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守 无菌操作，防止微生物污染［2］，制备 F1，（ 接收到合适菌种准 备使用时，应根据菌种 / 细胞株的说明书制备复活的培养基 对标准菌株、细胞株进行复活。清洁安瓿（ 可用 75% 乙醇） 后，用砂轮在安瓿的上部 1 /3 处划线，用干燥的无菌纱布包 裹安瓿，将安瓿掰开。用一无菌吸管吸取 0． 5 ～ 0． 8mL 适量 的液体培养基（ 生孢梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基； 大肠埃 希菌、金黄色葡萄球菌、短小芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和枯草

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。