冷冻切片技术 课件

2.1 CM 1900简介
• CM 1900是徕卡奉献给广大用户用于各种已知低温冷冻 切片的真正有效的仪器。 冷冻切片机用来将生物组织的 标本快速冷冻后，将标本在低温状态下进行微米级的超薄 切片，为生物组织的分析研究提供快速优良的组织切片。 • 特点： · 新型CM 1900的特色之一是具有大型冷冻室，可冷却到35°C。· 该仪器还提供一个独立的样品冷却系统，样品夹 温度的调节范围达到-10°C到-50°C，可进行不同类型 的样品切片，每一样品托有各自独立的温度，并可在很短 的时间内达到所需温度,快速冷冻台保持在-45°C，可同 时放多达10个样品，并和一个可持续冷却的吸热器相连， 可保证样品托上的样品快速冷却.高质量，无焊接缝的不 锈钢冷冻室表面光滑，利于清洁和防止污染。
2.2 操作
2.3 维护
2.4 故障排除
2.5. 冷冻切片的一点体会
• • 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻 费时，大者难以切完整，最好为正方或长方体： 1×1×0.5cm ；0.5 ×0.5×0.5cm 。 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速 放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上 包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织， 滴上包埋剂。 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进 退键，转动旋钮，将组织修平。 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞 密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～ 10um间。
规格参数：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 切片厚度：1至60um 最大样品：55 mm直径 样品臂前后移动：25 mm 样品臂上下移动：59 mm 样品臂前后移动速度：0.8mm/秒 冷冻箱温度:0至-35℃ 冷冻箱降温至:-35℃约4小时 除霜功能:以热气9分钟除霜,可自由于24小时内设置开始时间 可随时按制即时除霜. 快速冷冻台:至-45℃ 机身大小(长/深/高):890/730/1200mm 机身重量(连机切片):180kg 独特双压缩作样品快速冷冻及稳定冷冻切片温度 样品快速冷冻:-10℃至-50℃
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• 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的 调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调 较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片 能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平 整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板， 取一载玻片，将其附贴上即可。 • 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷 冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一 概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋 巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- 15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时， 可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应 调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至30℃。
• 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置， 所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱 放置，就不能收到很好的效果。 • 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固 定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速 冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间， 二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如 果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现 冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前， 其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时， 这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
• 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组 织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切 片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块， 以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 • 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于 室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取 出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当 温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由 于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时， 分子彼此间发生转移ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ产生了一种吸附力，使切 片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的 载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上 述的现象。
2.7 HE染色介绍
• 苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylineosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡 切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染 液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞 质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ， 主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红 色 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学 教学与科研中最基本、使用最广泛的技术 方法。
第二章 生物组织冷冻切片技术
冷冻切片技术
• 冷冻切片（frozen section）是一种在低温 条件下，将动物、植物组织快速冷却到一定 硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程 较石蜡切片快捷、简便，而应用广泛。冷冻 切片的种类较多，有低温恒冷箱冷冻切片法， 二氧化碳冷冻切片法，甲醇循环制冷冷冻切 片法等。
2.6 冰冻切片时的注意事项：
• 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净， 需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。 有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为 这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余 的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片， 便切片不能完整切出。 • 多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于 不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据 不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会 乱。
2.7.2 改进的冷冻切片HE染色步骤
• 固定 切好的切片用95 %乙醇95 ml + 冰醋酸5 ml 固定1 min ,自来水冲洗。 • 染色 用吸管将苏木素染液滴于玻片组织 块上,放于酒精灯加热染色0. 5 - 1 min 左 右,自来水洗去染色液,用1 %盐酸分化液分 化2 s ,放入40℃温水中返蓝,再入伊红Y染 液染色2 s ,递度酒精80%-95%-无水酒精 各2S脱水,电吹风吹干。 • 封片 中性树胶封片。
2.7.1 试剂配置
• 0.5~1% 的伊红酒精溶液： 称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解 后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过 滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精 （即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙 醇配制也可）100毫升溶解。
苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列 减少)
• 染色结果 细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙 盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红 染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性 颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色， 弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性 液体呈粉红色。 着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活 周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生 时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老 时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维 在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。
苏木精 6 g 无水乙醇 100 ml 硫酸铝钾 150 g 蒸馏水 2000 ml 碘酸钠 1.2 g 冰醋酸 120 ml 甘油 900 ml 配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝 钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最 后加入冰醋酸和碘酸钠。
• 1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入 99毫升70%酒精中即可。 • 促蓝液：1% 浓氨水溶液（1：99）