实验技术：组织切片的制备
点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，
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组织切片的制备
二）切片方法-细节注意
1 切片方法的选择
光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片
是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约
1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，
进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】
组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】
苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。苏木素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细胞浆染呈红色，常用作胞浆染色。
【材料】
1.试剂和溶液
（1）2-甲基丁醇(异戊醇)
（2）干冰
（3）O.C.T.(Tissue-Tek, SAKURA)
（4）冰冻或石蜡组织块
（5）酸性Harris 苏木素染料
（6）1％酸性酒精
70％酒精 99 ml
浓盐酸 1 ml
（7）醇溶性伊红染料
（8）酒精
（9）二甲苯
（10）树脂封片液
2.设备
（1）塑料模具
（2）长镊子
（3）Superfrost Plus玻片(Fisher Scientific) （4）盖玻片
（5）刀片(一次性或非一次性)；
（6）冰冻或石蜡切片机(Leica , Micorm 或其它)
【方法】
方法1、冰冻切片的制备
一、准备冰冻组织
1. 用塑料或不锈钢容器盛上2-甲基丁醇(异戊醇)，然后不时放入小块干冰，使温度降至-40ºC到-50ºC,并保持低温。
2. 标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部。
3. 收集组织标本。快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获得高质量免疫标记染色的最基本条件。
4. 将取下的组织标本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌满模具，直至标本完全被其覆盖。组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露。酌情调整组织标本的位置。用长镊子挟住模具，放入冷却了的2-甲基丁醇(异戊醇)溶液中。为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中5-10分钟。
（1）多数取下的组织标本可以直接放入模具。如标本沾有大量液体，应当用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋。不要用溶液清洗标本。
（2）需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-缓冲液处理，再冷冻包埋。
5. 将冻好的组织标本保存在-80ºC 冰箱以待使用。
二、制作冰冻切片
1. 切片前先将冰冻组织标本从-80ºC冰箱里取出，放在冰冻切片机(-20ºC) 内复温。
2. 用O.C.T.将冰冻组织块冻在冰冻标本盘上，然后将其固定在切片机上。调整好组织块平面与刀片的位置后，开始切片。直至切到预想的部位后，开始收集切片。根据研究目的的不同，切片可选择不同的厚度。3-6 µm是常用的切片厚度，也可以是25-50 µm厚。
3.切片在室温下晾干，然后用理想的固定液固定。如果选用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在经过20 分钟固定，并在室温下晾干后，可以直接用于染色，或者将其放在密封的切片盒并存入-80ºC冰箱，以待使用。
4. 余下的冰冻组织块，可用O.C.T.覆盖其暴露面，然后存入-80ºC冰箱以待下次使用。
方法2、石蜡切片的制备
1．收集组织标本并将其固定。10％福尔马林缓冲液是最常用固定液，也可根据实验的需要选用其它固定液。根据标本的大小，将其在室温下固定8-24小时，或更长。标本的厚度以不超过3 mm 最佳。完成固定后，标本即可进行下一步的处理。
2．制作石蜡组织块需要专用的设备，以及复杂的组织处理过程。通常由组织学或病理学实验室完成。
3．石蜡切片。准备好盛有40ºC蒸馏水的水浴箱，把包有组织的石蜡块固定在石蜡切片机上，根据需要切成一定的厚度(常用4-6 μm)，将切片浮在水浴箱的水面上，再转到Superfrost Plus片子上。切片在室温下自然风干过夜，贮存待用。
冰冻切片
(一)冷冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时*代的变迁，科技的发展，许多年前被
