(from web)细胞计数&台盼蓝染色

每代细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。

此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

持续 10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。

细胞株潜伏期一般为6～24小时。

④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。

机制：接触抑制、密度抑制细胞是否处于对数生长期并不是以数量来定的，一般接种数量多，潜伏期相对会缩短一些，反之，潜伏期会稍长。

并且不同细胞潜伏期是不一样的，故建议最好在实验以前做一下生长曲线细胞生长状况的观察1.细胞计数（1）［概述］细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态。

测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。

常用的细胞计数有血球计数板计数法和电子细胞计数仪计数法。

（2）［用品］a）血球计数板，巴氏吸管。

b）0. 25%胰蛋白酶溶液，无血清培养液。

c）显微镜。

（3）［步骤］a）准备计数板：用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。

b) 制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。

本法要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心(1000rpm，5 min)，重悬浮于少量培养液中。

c) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要过少或带气泡。

d) 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。

细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

e) 计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数／毫升原液=（4大格细胞数之和／4）× 104另外随着电子计数仪的出现，使大规模细胞计数工作自动化成为现实。

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定
体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

细胞计数
（1）先用巴氏管将细胞悬液混匀
（2）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液
流入旁边槽中。

用枪吸取54ul细胞悬液放在一片塑料纸上。

（3）再吸取6ul 台盼蓝染色液混入吸出的细胞悬液中。

（4）用枪头混匀混合液
（5）准备好细胞计数板，酒精棉球擦拭一遍。

吸10ul 细胞悬液沿盖玻片吹入，冲入池中，注意不要冲到两边的沟里。

（6）用20倍的显微镜计数，计数原则数上不数下，数左不数右。

（7）稀释倍数计算60/54=1.1
（8）计数公式=（4个大方格细胞总数/4）×104 ×稀释倍数（1.1）=个/ml
（9）说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）
×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000mm3
（10）注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）。

细胞计数方法——-－-—细胞计数板法实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中得细胞得数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞得细胞数目。

具体操作:１. 将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板。

２、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片与计数板之间,静置３miｎ,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。

3。

计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧与上方得。

然后按公式计算:细胞数/ｍL=四大格细胞总数/4×1０个／ml(注:当细胞很多时,可在四个格中选一定数目较平均得小格,由于每大格中有１6个小格,然后计左侧与上方得细胞数,求出每小格得细胞数,取平均值m,m×1６即每个格得平均值。

所以,细胞密度=m×1６×10个／ml)说明:公式中除以4,因为计数了４个大格得细胞数。

公式中乘以10因为计数板中每一个大格得体积为:１。

0mm(长)×1.0mm(宽)×０。

１mm(高)=0.1mm 而1ml=1０00ul＝１0０0ｍm (注意:镜下偶见有两个以上细胞组成得细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

)=========＝===============＝==＝=＝=＝＝===＝=＝＝====＝==细胞计数板得使用一、血球计数板-基本构造血球计数板就是一块特制得厚型载玻片,载玻片上有四个槽构成三个平台。

中间得平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各刻有一小方格网,每个方格网共分九个大格,中央得一大格作为计数用,称为计数区。

计数区得刻度有两种:一种就是计数区分为１６个大方格(大方格用三线隔开),而每个大方格又分成２5个小方格;另一种就是一个计数区分成２5个大方格(大方格之间用双线分开),而每个大方格又分成1６个小方格。

但就是不管计数区就是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成、计数区边长为１ｍｍ,则计数区得面积为1mm２,每个小方格得面积为1/400mm2。

细胞计数器使用方法细胞计数器使用方法1、细胞计数器接通电源，打开电源开关，十组数据和总数都显示“0”，若有显示不为“0”，则按一下“复位”键，使各组显示数据清零。

2、细胞计数器一般把常用的“中性分叶核、中性杆状核、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性晚幼粒、变异淋巴、天真细胞”九种血细胞计数对应在九个计数键上，若进行上述九种血细胞计数，可直接按动相应的计数键进行计数。

3、细胞计数器没有定义的其它细胞的分类计数，用户可在第“——”组计数器上自行定义，按动相应的计数键进行计数。

4、细胞计数器的计数键中按动其中任一个键，都会听到蜂鸣器的“嘟”声，表示计数有效，相应的计数器加“1”，而Σ总数同时加“1”。

若计数时没有听到蜂鸣器的“嘟”声，则表示该次计数无效，需重新计数。

5、当计数的总数达到“100”，则本次分类计数已计满，可听到“嘟”的长声，请记下各组数据。

按一下“复位”键，显示屏全部清零，可连续计数。

（单路计满时，总数显示“100”，单路显示“FF”。

）6、假如计数的总数没有计满“100”，而需结束本次测量时，可按一下“%”键，在听到“嘟”声后，电脑自动将各组数据换算成百分比值显示在对应的显示屏上。

假如需要再精准明确，则再按一下“%”键，显示各组数据百分比的小数位（此时指示灯亮），总数不变。

（单路计数未满“100”时，按下“%”键显示“—”，此时总数显示值即为单路计数值）。

7、每次测量结束时，按一下“复位”键，十组数据和总数Σ都为“0”，细胞计数器恢复到初始状态，可以进行下一次测量。

1、细胞计数器应水平放置，阔别强电磁场的干扰，交流电源应有良好接地线，电源电压应在规定的范围内。

2、按计数键时，手指应按键的中心部位，用力要适当，过轻易接触不良而不计数，过重易损坏键。

3、细胞计数器使用结束，应切断电源，盖上防尘盖，并保持干燥。

细胞计数方法--—--—细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中得细胞得数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞得细胞数目。

具体操作:1、将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板．2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片与计数板之间,静置3min,注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3、计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧与上方得。

然后按公式计算:细胞数/mL=四大格细胞总数/4×１0个/ml（注：当细胞很多时,可在四个格中选一定数目较平均得小格,由于每大格中有16个小格,然后计左侧与上方得细胞数,求出每小格得细胞数，取平均值m,ｍ×16即每个格得平均值。

所以,细胞密度=m×１6×10个/mｌ)说明:公式中除以4,因为计数了4个大格得细胞数。

公式中乘以10因为计数板中每一个大格得体积为：1、0mm(长）×1、0mｍ(宽）×0、1mｍ(高)=0、1mm 而1ml＝1000ｕl=1０００ｍm(注意:镜下偶见有两个以上细胞组成得细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

)========＝==＝＝=====＝===＝=＝＝＝=====＝======＝====＝===细胞计数板得使用一、血球计数板-基本构造血球计数板就是一块特制得厚型载玻片,载玻片上有四个槽构成三个平台。

中间得平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各刻有一小方格网,每个方格网共分九个大格,中央得一大格作为计数用,称为计数区.计数区得刻度有两种：一种就是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开）,而每个大方格又分成2５个小方格;另一种就是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开),而每个大方格又分成16个小方格。

但就是不管计数区就是哪一种构造,它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

细胞计数法细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。

一般利用计数板（血球计数板）进行。

即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。

不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

1、制备细胞悬液对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。

如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。

1）、终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。

2）、给培养瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化3～5min 。

期间不断在镜下观察。

当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。

3）、加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。

2、计数与计算过程1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。

对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4）、按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml表示不计数：注意事项：1）、务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。

2）、显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。

如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm2或>500个/10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。

二.细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks 液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

细胞培养之细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.二.细胞悬液制备：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。

三.细胞计数：1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。

活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3四.细胞计数要点：1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。

细胞计数板计数原理什么是细胞计数板细胞计数板，也称为海姆斯希计数板（Hemocytometer），是一种常用的实验室工具，用于计数和测量细胞数量。

它通常由玻璃制成，具有一个规定大小的网格板和一个盖片，网格板上刻有成规定尺寸的小方格。

通过在细胞计数板上放置细胞样品，然后通过显微镜观察和计数来确定细胞的浓度和数量。

细胞计数板的主要原理细胞计数板的计数原理基于以下几个方面：1. 成浓缩在使用细胞计数板之前，通常需要对细胞样品进行合适的稀释。

这是为了使细胞浓度在可观察范围内，并且避免细胞过于密集而无法准确计数。

通常使用缓冲溶液或染色剂来稀释样品。

2. 通过计数网格来估算细胞浓度细胞计数板的上方刻有一个特定尺寸的计数网格，通常是一个9或16个小方格组成的大方格。

每个小方格都再次划分成16个更小的方格。

通过显微镜观察，将视野对准计数板上的网格，并记录每个小方格中的细胞数量。

3. 统计与浓度计算在细胞计数过程中，对细胞数量进行计数，并记录每个小方格中的细胞数。

然后，将每个小方格中的细胞数加总，根据总数以及某个特定体积的稀释液，可以推算出细胞的浓度。

细胞计数板的使用步骤下面是一般情况下使用细胞计数板的步骤：1.准备样品稀释液：根据细胞样品的浓度，将其使用合适的溶液（比如缓冲溶液）稀释到合适的浓度，使细胞数在500至5000个之间。

2.取一小部分稀释后的细胞样品并将其放置在细胞计数板的装载槽中。

注意不要过量装载以确保细胞在每个小方格中均匀分布。

3.将细胞计数板覆盖盖片，确保细胞在网格上均匀分散。

4.使用显微镜将细胞计数板放置在平台上，并选择适当的放大倍数来观察细胞。

5.计数过程：从一个固定的起点开始，观察每个小方格并记录其中的细胞数。

按照一定的顺序，逐个计算每个小方格中的细胞数并记录。

6.统计计数：将每个小方格中的细胞数加总，并将总数除以小方格的数量得到每个小方格的平均细胞数。

7.计算细胞浓度：通过将每个小方格的平均细胞数乘以稀释液的体积来计算细胞的浓度。