细胞的原代培养(Cell primary culture)

原代细胞培养过程细胞是生命的基本单位，是构成生物体的基本组成部分。

细胞的研究对于生命科学的发展具有重要的意义。

原代细胞是从组织或器官中分离出来的未经过传代的细胞，具有较高的生物学活性和生物学特性，是细胞学、生物学、医学等领域的重要研究对象。

原代细胞培养是将原代细胞在体外培养的过程，是细胞学研究的重要手段之一。

原代细胞培养的目的原代细胞培养的主要目的是为了研究细胞的生物学特性、生长和分化规律、细胞信号传导、细胞凋亡、细胞周期等方面的问题。

同时，原代细胞培养还可以用于药物筛选、毒性测试、细胞治疗等方面的研究。

原代细胞培养的步骤原代细胞培养的步骤主要包括细胞分离、细胞培养、细胞传代等。

1. 细胞分离细胞分离是将组织或器官中的细胞分离出来的过程。

常用的细胞分离方法有机械分离、酶消化、胶原酶消化等。

其中，酶消化是最常用的方法之一。

酶消化可以使细胞间的胶原纤维、基质等物质被消化，从而使细胞分离出来。

酶消化的时间和酶的浓度需要根据不同的组织和细胞类型进行调整。

2. 细胞培养细胞培养是将分离出来的细胞在体外培养的过程。

细胞培养需要提供适宜的培养基、培养条件和培养器具。

培养基是细胞培养的基础，包括营养物质、生长因子、激素等。

培养条件包括温度、湿度、氧气浓度、CO2浓度等。

培养器具包括培养皿、培养瓶、细胞培养箱等。

3. 细胞传代细胞传代是将原代细胞在体外培养的过程中，将细胞分离并继续培养的过程。

细胞传代的次数越多，细胞的生物学特性和生物学活性就越低。

因此，在进行原代细胞培养时，需要根据实验的需要和细胞的特性来确定细胞传代的次数。

原代细胞培养的注意事项1. 细胞分离时需要注意细胞的完整性和活性，避免对细胞造成损伤。

2. 细胞培养时需要注意培养基的配制和培养条件的控制，避免对细胞造成不良影响。

3. 细胞传代时需要注意细胞的生长状态和细胞的传代次数，避免对细胞造成不可逆的影响。

4. 细胞培养过程中需要注意细胞的无菌性和培养器具的消毒，避免细胞被细菌、真菌等微生物污染。

组织细胞培养概述组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。

其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。

器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。

组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。

细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。

（一）体外培养方式的分类体外培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。

传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。

原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。

如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。

（二）体外培养细胞的分型根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。

1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。

细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。

细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。

在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。

原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。

通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。

原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。

传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。

在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。

传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。

在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。

冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。

冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。

冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。

## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。

推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。

如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。

正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。

在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。

细胞融合：是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的过程。

细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）：细胞融合与细胞杂交技术-真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。

呼吸链（电子传递链）：线粒体内膜上存在多种酶与辅酶组成的电子传递链，可使还原当量中的氢传递到氧生成水。

细胞周期：细胞从前一次分裂结束开始到下一次分裂完成，称为一个细胞周期。

有丝分裂促进因子(MPF)：调节细胞进出M期所必需的蛋白质激酶，具有广泛的生物功能；通过促进靶蛋白的磷酸化而改变其生理活性。

MPF自身活性随细胞周期的运转而发生周期性变化。

干细胞：机体中未分化的、具有永久细胞分裂潜能、具有不断更新潜能、具有细胞分化潜能的细胞群体。

相当一部分干细胞处于休眠状态。

受体：能够识别和选择结合信号分子并能引起一系列生物学效应的生物大分子奢侈基因：对细胞本身生存无直接影响，却对细胞分化起极为重要作用的基因。

管家基因(House-keeping gene)：维持细胞最基本生命活动所必需的基因，即译制基本生命活动所必需的结构和功能蛋白的基因，与细胞分化关系不大。

细胞全能性：各种分化状态的细胞虽然结构和功能不同，但都保留着与合子同样的基因组，即分化本身仍然有生物个体生长发育所需要的全部遗传信息，这称为细胞的全能性(Totipotency)。

细胞分化(Cell Differentiation) ：同源细胞逐渐变为结构、功能与生化特征相异的细胞过程。

多聚核糖体：是指合成蛋白质时，多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA分子上，形成的似念珠状结构。

收缩环：有丝分裂的后、末期，在赤道板质膜下形成的微丝束环（由肌动蛋白和肌球蛋白组成）。

核纤层：核纤层是位于细胞核膜下的纤维蛋白片层或纤维网络，核纤层由1至3种核纤层蛋白多肽组成。

细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。

原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。

特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。

在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。

在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。

但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。

即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。

其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。

原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。

假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。

有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。

在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。

借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。

而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。

细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。

传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。

原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。

通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。

但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。

第一章绪论1、细胞生物学（cell biology）：是研究细胞基本生命活动规律的科学，是在显微、亚显微和分子水平上，以研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，细胞信号传递，真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等为主要内容的一门学科。

2、显微结构（microscopic structure）：在普通光学显微镜中能够观察到的细胞结构，直径大于0.2微米，如细胞的大小及外部形态、染色体、线粒体、中心体、细胞核、核仁等，目前用于研究细胞显微结构的工具有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等。

3、亚3、显微结构（submicroscopic structure）：在电子显微镜中能够观察到的细胞分子水平以上的结构，直径小于0.2微米，如内质网膜、核膜、微管、微丝、核糖体等，目前用于亚显微结构研究的工具主要有电子显微镜、偏光显微镜和X线衍射仪等。

4、细胞学（cytology）：研究细胞形态、结构、功能和生活史的科学，细胞学的确立是从Schleiden（1838）和Schwann（1839）的细胞学说的提出开始的，而大部分细胞学的基础知识是在十九世纪七十年代以后得到的。

在这一时期，显微镜的观察技术有了显著的进步，详细地观察到核和其他细胞结构、有丝分裂、染色体的行为、受精时的核融合等，细胞内的渗透压和细胞膜的透性等生理学方面的知识也有了发展。

对于生殖过程中的细胞以及核的行为的研究，对于发展遗传和进化的理论起了很大作用。

5、分子细胞生物学（molecular cell biology）：是细胞的分子生物学，是指在分子水平上探索细胞的基本生命活动规律，主要应用物理的、化学的方法、技术，分析研究细胞各种结构中核酸和蛋白质等大分子的构造、组成的复杂结构、这些结构之间分子的相互作用及遗传性状的表现的控制等。

第二章细胞的统一性与多样性1、细胞（cell）：由膜转围成的、能进行独立繁殖的最小原生质团，是生物体电基本的开矿结构和生理功能单位。

实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。

2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。

进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。

细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。

所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。

原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。

一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。

传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。

细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。

培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。

将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。

要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。

此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。

贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。

加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。

但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。

常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。

二者可分别使用，也可共同使用。

钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。

细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。

细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。

原代细胞培养方法原代细胞培养方法一、介绍原代细胞培养的概念和重要性：原代细胞是从人或动物体内初次分离出的细胞，具有体内组织原始性和遗传特性的稳定性。

原代细胞培养是一种重要的实验手段，广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域。

通过原代细胞培养，可以研究细胞的生长、分化、凋亡以及与疾病相关的分子机制等。

二、准备原代细胞培养的基本设备和试剂：1. 培养箱和细胞培养用的培养皿：培养箱提供恒温和湿度控制，保持培养环境的稳定；培养皿用于细胞的贴壁培养和传代。

2. 细胞培养无菌耗材：如细胞培养板、培养瓶、离心管等。

3. 细胞培养液：如DMEM、RPMI 1640等。

需根据实验需求选择适当的培养液，并添加适当浓度的血清、生长因子等。

4. 酶消化液：如胰蛋白酶、胶原酶等，用于细胞的分离和传代。

5. 生物安全柜和消毒液：用于操作细胞时的无菌保护和实验室的消毒。

三、原代细胞培养的步骤：1. 组织样本的收集：选择合适的组织样本，如肺、肝脏、肾脏等，进行无菌采集。

2. 组织的消化：将组织样本切成小块，加入适量的酶消化液，在恒温摇床上消化一段时间，使细胞分散。

3. 细胞的离心和洗涤：将消化后的细胞离心，去除酶消化液，并用适量的培养液洗涤细胞，去除残留的异物和垃圾。

4. 细胞的贴壁培养：将洗涤好的细胞转移到培养皿中，加入适量的培养液，将培养皿放入培养箱中，培养维持适当的温度和湿度。

5. 细胞的传代：当细胞达到一定密度时，用酶消化液进行细胞的分离和传代，将细胞转移到新的培养皿中，以保证细胞的生长和扩增。

四、原代细胞培养的注意事项：1. 保持无菌操作：在生物安全柜中进行细胞培养，并使用无菌试剂和耗材，避免细菌和真菌的污染。

2. 控制培养条件：根据不同细胞类型的要求，调整培养液中的成分和浓度，以及培养箱中的温度和湿度。

3. 注意细胞的健康状态：细胞的形态、增殖情况和凋亡等指标应定期观察和记录，及时发现和解决细胞培养中的问题。

4. 合理的细胞传代次数：每个细胞类型的传代次数有一定限制，过多的传代会导致细胞功能和稳定性的下降。

人肺的成纤维细胞1.准备2个50ml的离心管，加入20ml的1640+10%FBS+0.1%三抗。

置于冰盒内。

手术标本取距离肿瘤2cm的标记CAF；距离肿瘤大于2cm的标记NF。

取回的组织在超净台内处理。

2.用1%双抗PBS清洗组织，直至溶液清洗。

尽量去除血清及杂志。

去除血管（黑）等附属物。

3.用剪刀剪碎组织（时间5min以内），大小1mm3,加入双抗PBS,将组织吹散，静止15min,更换新的PBS，离心沉淀组织块。

4.用FBS打湿25cm2培养瓶底，吸掉多余的FBS，静置。

准备200ul 的tip剪掉尖头，用火烧弯。

200ul的tip吸取组织快，接种于培养瓶内，每瓶大约25块。

将培养瓶倒置，加入2ml的1640+10%FBS+0.1%三抗，置于培养箱中，6.除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。

注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。

7.传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 –1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。

鼠成纤维细胞的原代培养1.小鼠颈椎脱臼致死,置于75%的酒精中,转移到超净台内.2.酒精擦拭小鼠2次.镊子夹取皮肤,剪开笑口,钝性分离.剪开肿瘤块外包膜(NF)一个小口,剥离出肿瘤块放入一个培养皿中.剪掉外包膜,放入另一个培养皿中（NF）.洗涤两次.封口转移至细胞放内.3.NF培基吸走,用剪刀剪碎至0.5-1mm3CAF剪取肿瘤块的内包膜，剪碎至0.5-1mm3Ⅳ型胶原蛋白（或胰酶），4℃（或37℃）培养箱过夜。

（或者此步骤省掉）。

4.用纯的血清或者20%血清浸湿组织块。

弯头吸管（注射器）吸取组织块，培养瓶种植0.5CM间隔，15-20块/25ML培养瓶。

5.将组织块加到培养瓶壁上，竖起，培养箱中培养2-4h，直至贴壁。

加入培养基培养。

翻动培养瓶使底朝上，加入2-3ML的培养基，塞紧瓶塞，置于培养箱，2-3h,待组织贴壁。

原代细胞培养步骤
原代细胞培养步骤如下：
1. 准备：消毒培养用品，安装吸管帽。

2. 处理组织：漂洗组织块，去除血污。

3. 剪切：用手术刀将组织切成若干小块。

4. 消化：用胰蛋白酶液消化，加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液。

5. 分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化。

6. 计数：用计数板计数，对大多数细胞来说，pH需要控制在
7.2-7.4范围内。

7. 培养：置于37℃的CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布棉塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

注意，原代细胞的培养得保证无菌环境，并且细胞生长所需要的营养成分得充足。