鸡胚细胞原代培养

鸡胚原代细胞的培养{能力目标}·了解鸡胚的发育过程。

·掌握鸡胚原代细胞制备及培养技术。

{实验器材}(1)Hank's液、含10%~20%血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。

(2)超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、吸尔球、灭菌吸管、平皿、毛吸管、离心管、剪刀、小镊子、培养箱、倒置显微镜。

{实验内容及操作步骤}一、鸡胚的孵育受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，人温箱培养。

在温箱底部放上一盘水，将温度调至37.8℃即可。

二、鸡胚的发育过程(1)观察方法：将9~12日龄的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。

(2)鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。

鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。

在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。

发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。

一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。

至第4~5d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。

羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。

尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。

外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。

绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。

此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15d之间出现。

'胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。

在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d 后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。

第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。

目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。

可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。

虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。

鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。

当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。

因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。

原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。

一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。

在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。

孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。

鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。

如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。

气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。

鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。

在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。

要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。

组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。

组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。

很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。

细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。

组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。

原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。

本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。

（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。

2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。

3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。

（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。

以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。

2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。

第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。

目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。

可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。

虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。

鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。

当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。

因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。

原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。

一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。

在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。

孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。

鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。

如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。

气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。

第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。

目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。

可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。

虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。

鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。

当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。

因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。

原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。

一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。

在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。

孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。

鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。

如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。

气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。

鸡胚培养和细胞培养第⼀节鸡胚接种⼀、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多⼈类和动物病毒的⽣长增殖，是常⽤的病毒分离培养⽅法之⼀（⾐原体、⽴克次体的分离亦⽤鸡胚）。

⽬前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应⽤较多。

可⽤于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。

虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再⽤鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是⼀种不可缺少的培养⼿段。

鸡胚培养的优点是，来源充⾜，价格低廉，操作简单，⽆需特殊设备或条件，易感病毒谱较⼴，对接种的病毒不产⽣抗体等。

当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需⽤第⼆试验系统来测定病毒存在与否；⾮ SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚⾄还可能带有鸡⽩痢沙门⽒菌、霉形体、鸡⽩⾎病等病毒。

因此，⽤鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。

原则上应使⽤⾮免疫蛋来孵鸡胚，最好⽤ SPF 鸡胚。

⼀般说来，孵育⾄ 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的⽣长，因为此阶段鸡胚发育⽇趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，⾻胳不健全，还未长出⽻⽑，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获⾼滴度的病毒，14 天以后，胚胎⾻骼硬化，胚⽪表⾯⽻⽑渐⽣，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。

在操作鸡胚时）⼀定要注意到这⼀点。

孵育⾄ 21 天左右，⽺⽔和尿囊液已全部被胚胎吸收，⼀部分卵黄陷⼊胚胎腹部，另⼀部分则仍留在体外，胚胎已发育成⼩鸡，破壳⽽出。

鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为⽯灰质的卵壳，上有⽓孔供⽓体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使⽓体分⼦与胚胎内的液体分⼦在内外进⾏交换，因此在孵育时需要有⼀定的湿度和空⽓。

如果湿度太低，鸡胚就容易脱⽔、引起鸡胚死亡。

⽓流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。

鸡胚原代细胞的培养[实验目的]掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。

[实验材料]9~10日龄鸡胚，Hank`s液（已含0.5%乳蛋白水解物），0.25%胰蛋白酶，NaHCO，双抗，3牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠（置于三角瓶内），漏斗，纱布（置于漏斗中），30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。

[实验内容及操作程序]1、配液在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素100ug/ml。

胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液（简称H液）按1:9比例稀释。

用7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4（玫瑰红色）。

32、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。

剪去头部、翅爪及内脏，用H 液洗去体表血液。

用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，用H液小心洗涤2次。

3、消化将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。

待液体变混而稍稠，中止消化。

4、分散取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振摇三角瓶，以使细胞分散下来。

加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。

继续用力振摇三角瓶，加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。

5、加入血清在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。

塞好瓶塞，轻摇细胞瓶混匀。

6、分装将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。

塞紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养。

4h后细胞可贴附于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维持液，并接种病毒。