实验一——鸡胚成纤维细胞的培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。

（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。

（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。

DMSO一定要配成10%。

鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。

用碘酒、酒精消毒蛋壳。

用镊子打开气室。

4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。

5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。

7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。

8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

消化10－15分钟。

一般约12分钟。

视鸡胚日龄大小而定。

越小消化时间越短。

见组织松软即可。

一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。

9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。

（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。

使细胞分散，脱落。

然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。

10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

实习三鸡胚成纤维细胞（CEE）的制备目的：1.初步掌握CEE的培养方法和待染色的细胞培养物的制备。

2.了解一般细胞培养要求的条件。

材料：10~12天龄鸡胚、BSS（每100ml加3.5%NaHCO3和庆大霉素各1.0ml）、Hanks水解乳蛋白液（每100ml加小牛血清5ml、庆大霉素1ml）、小牛血清、0.06%胰酶、3.5%NaHCO3、庆大霉素（5000单位/ml）、蛋架、剪刀、镊子、铁线钩、烧杯、三角瓶、、链霉素瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、培养架、酒精灯、酒精棉、漏斗及尼龙滤网、离心管、天平、平衡杯、离心机、羊皮纸、1/2盖玻片等。

内容与方法：1．准备好平皿、烧杯、三角瓶、细胞瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、漏斗子，及尼龙滤网、离心管、1/2盖玻片等。

预先包扎好，15磅30分高压灭菌。

小铁钩、剪刀和镊子等可在用前煮沸15分钟。

2．用碘酒棉和酒精棉消毒蛋壳，无菌操作打开蛋的气室，钩起鸡胚，在平皿内剪去头、脚及去掉内脏，然后放入烧杯内，并尽量剪碎胚体。

3．用约10ml BSS将组织碎块倒入三角瓶，并冲洗2次，以除去其中的红细胞。

4．加入0.06%胰酶10ml，于37℃水浴消化约10分钟，迅速用BBS将组织碎块轻轻冲洗2次，最后一次冲洗液弃去后即加10ml营养液（营养液里的血清将终止残存胰酶的作用），用吸管反复吹打组织碎块，直至大部分细胞分散而上层液变浑浊。

5．经100目尼龙滤网滤入离心管，并用羊皮纸封口，平衡后1000r/min离心5分钟，弃去上层液，确定细胞压积后，以1：300的稀释倍数加入新的营养液，然后重新悬浮细胞。

6．每一细胞瓶加入细胞悬液；制备待固定、染色的细胞培养物可在瓶内加入半块盖玻片，使其浸入细胞悬液中。

在瓶上方做上标记，置37℃培养，1~2天后CEE可生长形成单层。

实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。

①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。

②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。

理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。

2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。

（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。

2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。

说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。

这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。

配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。

2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。

3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。

4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。

5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。

注意不要过分搅拌。

6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。

实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。

⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。

通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。

原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。

三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。

4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。

7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。

鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。

○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。

②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。

③再用PH7.2的PBS冲洗两次。

④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。

⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。

⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。

⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。

⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。

⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。

11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。

一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。

2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。

3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。

4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。

5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。

6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。

7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。

8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。

9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。

10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。

11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。

12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。

13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。

14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。

15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。

鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。

二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。

2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。

第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。

静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。

必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。

在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。

二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。

计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。

鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。

用碘酒、酒精消毒蛋壳。

用镊子打开气室。

4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。

5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。

7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。

8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

消化10－15分钟。

一般约12分钟。

视鸡胚日龄大小而定。

越小消化时间越短。

见组织松软即可。

一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。

9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。

（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。

使细胞分散，脱落。

然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。

10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。

将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。

最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。

抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。

经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。

体液免疫：
吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。

抗体处理抗原——（效应阶段）
有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。

这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的
细胞免疫：
T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。

效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。

然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。

成纤维细胞的培养1前言成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。

根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。

在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。

通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。

由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。

2材料和方法2.1材料玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管塑料器材：细胞培养板橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜2.2试剂的配制水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、2.3方法2.3.1试剂配制（1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水（2) 组织冲洗液：无血清MEM（3）细胞生长液：含10％FCS MEM2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。

鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。

1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。

而呈现悬浮生长的细胞。

贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。

又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。

✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。

✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。

此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。

✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。

细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。

如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

鸡胚成纤维（CEF）细胞的制备材料准备：干烤好的漏斗，高压好的12层纱布，50ml的烧杯，锥形瓶，剪刀，镊子，平皿，Hank’s液，含10%血清的199培养基，胰酶，19日龄SPF鸡胚（CEK细胞），9日龄SPF 鸡胚（CEF细胞）。

取胚：用新洁尔灭对鸡蛋外壳进行消毒，用碘酒消毒气室部位蛋壳，再用75%酒精脱碘消毒，剪碎气室部位蛋壳，取出鸡胚，剪断鸡胚与卵黄连接的脐带，将鸡胚放置干净的平皿上。

取组织：取小烧杯，倒入适量微温Hank’s液，将鸡胚仰放，制备CEK细胞除去胃、肠、肝脏、肺脏、心脏等器官，用小镊子将嵌入在脊椎两侧的肾脏取出，浸泡在Hank’s液中；制备CEF细胞去掉头、翅膀、腿和内脏，将剩余的胴体放入50ml的烧杯。

漂洗，剪碎：用Hank’s也漂洗3次，将组织脏器剪成1mm3左右的小块，再用Hank’s液漂洗3次。

胰酶消化：将小烧杯中的组织小块移到锥形瓶中，加入适量37℃水浴加热的胰酶溶液，放在水浴锅中消化30-35min。

终止消化：待组织体积增大、边缘出现毛边停止消化，小心倒出胰酶，用Hank’s液洗3遍。

制备细胞：除去Hank’s液，加入适量含10%血清的199培养基，剧烈震荡，将液体倒入含12层纱布的漏斗，重复数次，一般按1个胚加入25mL培养基来计算培养基总量。

活细胞计数：用血球计数板进行台盼兰细胞计数。

用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计数板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液；取一吸管伸入培养瓶，轻轻吸打，混匀细胞悬液；用微量移液枪从盖片边缘滴加20μL细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中；勿使液体漫过盖片或出现气泡；镜下观察并计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右侧和下方的不计算在内；细胞数/毫升原液=(4大格细胞数/4)×10000×稀释倍数。

每4个大方格计数，以80-120个为宜。

未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，进行活细胞计数：用台盼兰染色进行活细胞计数后，调整CEK、CEF细胞密度至100×104个/mL左右，25cm2塑料细胞培养瓶中接入8mL细胞分散液，置于37℃细胞培养箱静置培养。

鸡胚成纤维细胞原代培养实验材料、用品鸡胚：9—11日龄器材：平皿、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、离心机、天平、离心管、100目不锈钢网、镊子、眼科小剪、细胞计数器、枪头、移液器等。

试剂：Hanks液、完全培养液、血清、碘酒、酒精方法1．取胚：取9-11日龄鸡胚，碘酒、酒精消毒气室部，去除气室部蛋壳,用无菌小镊取出鸡胚于无菌平皿中.2．去头、爪、内脏，鸡胚组织Hanks液洗2次,除去红细胞，剪成1mm3组织块，用Hanks液洗2次，800rpm3min,去上清.3．加2倍体积胰酶搅拌消化15—30min，分散好的细胞悬液加完全培养基,通过不锈钢筛网，滤液离心,沉淀加完全培养液，分散.4．细胞计数，接种培养与分装：取单细胞悬液少量,进行1：5或1：10稀释后计数，然后调至细胞浓度为1x106／ml。

细胞计数方法:取细胞悬液,计数4角4个大方格细胞总数,用下式计数：培养细胞的活性检查材料1．细胞2． 0。

4 % w/v trypan blue、75％乙醇.3．培养瓶，无菌吸液管（5ml 及1m1)、废液瓶、盖玻片。

4. 倒置显微镜、计数器、血球计数板、离心机、C02培养箱、超净台、枪头、移液器。

方法1细胞悬液制备1)选生长良好的细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶，悬浮细胞碎片,吸出生长液，用Hanks液洗一次;2）加入适量0。

25％胰蛋白酶液，使消化液浸没细胞，置37℃培养箱，1min左右，镜检。

3)待细胞圆缩后,吸出消化液。

4）置37℃培养箱，随时镜检，。

5）待细胞变圆，加入完全培养基，洗下细胞，吹打混匀。

2取细胞悬浮液50ul与等体积trypan blue混匀.3 取10ul混合液滴入血球计数板，于100 倍倒置显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色。

4 计数：培养细胞传代材料1．细胞培养物2．Hanks液，0。

25％胰酶,培养基3．培养瓶、废液瓶、倒置显微镜、计数器、血球计数板、离心机、C02培养箱、超净台、离心管、枪头、移液器。