培养基适用性检查规程

培养基适用性检查SOP1．目的规范计数培养基的适用性检查，确保微生物限度检查培养基计数的准确性。

2．范围适用于本公司检定用菌种。

3．定义无4．职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。

5．引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6．材料6.1.房屋、设备、试验用具6.1.1.房屋：阳性实验室6.1.2.设备：100级洁净工作台，30～35℃培养箱，20～25℃培养箱，立式灭菌器6.1.3.试验用具：隔离服、洁净工作服、工作鞋、口罩、帽子、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管、毛巾、吸耳球、记号笔、中试管架、酒精灯、镊子、酒精棉、三角瓶、托盘、电子天平、药勺、量筒等。

6.2.菌种检查所用菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26003〕：用于无菌实验培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕：用于无菌实验培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98001〕：用于无菌实验培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98003〕：用于无菌实验培养基灵敏度检查及微生物限度培养基的适用性检查；大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕：用于微生物限度培养基的适用性检查；6.3.培养基:营养琼脂斜面培养基（中管）、硫乙醇酸盐流体培养基（中管）、改良马丁琼脂斜面培养基（中管）6.4.试剂与配制0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加注射用水1000ml，充分溶解摇匀，加塞、包扎，经121℃30分钟高压灭菌，即得。

培养基适用性检查规程目的：建立一个培养基的灵敏度检查，确保培养基性能可靠。

范围：适用于微生物检验。

责任：微生物检验员。

依据：《中国药典》2010年版一部附录、2010版GMP实施指南规程：1.不应在同一无菌室内同时操作2个或2个以上菌株。

2.菌株传代次数不得超过5代（以菌种保存中心获及的冷冻干燥菌种为第0代）。

一、计数培养基的适用性检查1、菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在两小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。

2、适用性检查取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml（50-100cfu）,分别注入无菌平皿中，立刻注入待检查营养琼脂培养基和对照营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（其中2个注入待检查营养琼脂培养基，另两个注入对照营养琼脂培养基）。

30-35℃培养48h，计数。

取白色念珠菌1ml（50-100cfu）,注入无菌平皿中，立刻注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基和对照玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备4个平皿（其中2个注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基，另两个注入对照玫瑰红钠琼脂培养基）。

23-28℃培养72h，计数。

3、结果判断若被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落数的70%，且菌落大小、形态两者一致，判断该培养基的适用性检查符合规定。

二、控制菌检查用培养基的适用性检查1.菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu、每1ml50-100cfu和每1ml大于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。

范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。

依据：中国药典》2015年版《药品生产质量管理规范》2010年修订《中国药品检验标准操作规程》2010年版责任：QC化验员对实施本规程负责。

内容:1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。

本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。

2、材料及设备2.1 生化培养箱2.2 生物安全柜2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供）2.4 灭菌试管、灭菌注射器2.5 0.9%无菌氯化钠溶液2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。

3、无菌检查培养基的适用性检查3.1无菌性检查取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃，培养14天，应无菌生长。

3.2灵敏度检查3.2.1菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003]铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104]枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC(B) 63501]生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC(B) 64941]白色念珠菌[Candida albicans CMCC(F) 98001]黑曲霉[Aspergillus niger CMCC(F) 98003]3.2.2菌液制备3.2.2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液制备3.2.2.1.1 取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，取新鲜传代菌种一支待用。

培养基适用性验证方案培养基适用性验证是指在培养基的研发过程中，通过实验验证培养基的适用性和质量。

这一过程对于生物学、医学等领域研究以及工业生产来说非常重要。

本文将介绍一个基本的培养基适用性验证方案，以确保培养基的质量和有效性。

一、实验目的1.验证培养基中各种成分的适用性和稳定性；2.测试培养基对细胞或微生物的生长和增殖的支持程度；3.评估培养基对细胞或微生物的表型和基因表达的影响；4.了解培养基的理化指标，如pH值、渗透压等。

二、实验步骤1.准备培养基和试样：根据所研究的生物体或微生物的需要，准备相应的培养基，包括成分和浓度。

同时，准备不同的试样，如细胞或微生物的悬浮液或分离物等，用于验证培养基的适用性。

2.测定培养基理化指标：测定培养基的理化指标，如pH值、渗透压、离子浓度等，确保其在范围内。

3.测定培养基对细胞或微生物的生长和增殖的支持程度：将细胞或微生物接种于培养基中，通过监测生物体的生长曲线、增殖速率等参数来评估培养基对其的支持程度。

可以使用细胞计数仪、显微镜等工具进行观察和计数。

4.评估培养基对细胞或微生物的表型和基因表达的影响：通过观察生物体的形态、结构、活力等方面，了解培养基对其表型的影响。

同时，可以通过转录组分析、蛋白质组分析等手段，评估培养基对基因表达的影响。

5.验证培养基的稳定性：将培养基保存一段时间后，再次进行生物体的培养和生长实验，以验证培养基的稳定性和持久性。

6.数据分析和结果呈现：对实验结果进行统计分析，包括均值、标准差等指标，通过图表、表格等形式呈现实验结果。

三、实验注意事项1.实验室条件要符合要求，包括洁净无菌、合适的温度和湿度等；2.培养基的配制要精确，注意称量和混合时间；3.使用无菌技术和条件进行细胞或微生物的接种和培养；4.实验过程中要使用适当的控制组和重复实验，以确保实验结果的可靠性和准确性；5.实验过程中要严格按照操作规程和实验流程进行，避免误操作和实验结果的偏差。

1. 目的：通过培养基适用性检查，确保购买的培养基符合实验要求。

2. 范围：本规程适用于技术质量部实验员对培养基适用性的检查。

3. 职责：质量部实验员负责执行此规程。

4. 内容：4.1 检验依据：《中华人民共和国药典》2015版4.2 试验用具：烧杯、三角瓶、酒精灯、接种环、平皿、试管、吸管、移液枪、滴管、电子天平、电热恒温培养箱、生化培养箱或恒温恒湿培养箱、单人净化工作台、高压蒸汽灭菌器、微生物限度仪、漩涡混合器、试验菌种、检查用培养基等。

4.3 无菌培养基适用性检查：本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

4.3.1 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基（培养基的配制按《培养基配制操作规程》配制）。

4.3.2 稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

a) 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。

b) pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

c) 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

4.3.3 无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

4.3.4 灵敏度检查4.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔CMCC（B）10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕4.3.4.2 菌液制备a) 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；b) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48小时，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

文件名称培养基适用性检查标准操作规程文件编号：SOP-QC-000-03起草人：起草日期：部门：审核人：审核日期：页码1/6审核人：审核日期：版本号03批准人：批准日期：生效日期颁发部门质量部分发部门质量部、质量保证室、质量控制室1目的建立培养基适用性检查的标准操作规程，保证微生物限度检查结果的准确性和可靠性。

2范围适用于微生物限度检查中成品培养基、脱水培养基或按处方配制的培养基。

3 职责质量部组织制订，微生物限度检查操作人员负责实施。

4 内容4.1依据：《中国药典》2015年版四部。

4.2概述：4.2.1培养基质量是影响微生物限度检查结果的重要环节。

计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。

4.2.2培养基适应性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。

4.2.3微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。

4.2.4微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则4.2.4.1不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适应性试验简单确定。

4.2.4.2如果没有特殊规定，培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可，但应采取一定措施加以检测控制；如蒸馏水应测PH 值是否为5～7；采用离子交换法制备的纯化水，电阻值应不小于2МΩ等。

4.2.4.3尽量现用现配。

培养基灭菌后在能取出的前提下，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留；固体培养基灭菌或熔化后，融化状态放置不得超过8h ；固体培养基熔化再使用应不超过一次；一般预制培养基可置洁净环境2～25℃保存，但不应超过21天。

4.2.4.4干粉培养基变质、过期均不应再用；预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化均不应再用。

培养基适用性检查操作规程编制人：日期：部门：微生物室审核人：日期：替代：批准人：日期：执行日期：1、目的建立一个培养基适用性检查操作规程。

2、适用范围微生物限度及无菌检查的成品培养基，由脱水培养基或按处方配置的培养基均应进行培养基适用性检查。

3、检验依据按2010年版《中国药典（一、二部）》附录无菌方法进行测试检查。

4、试验所需菌种大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌；黑曲霉。

5、标准规定5.1 无菌培养基使用性检查5.1.1 无菌性：每批培养基随机取不少于5支（瓶），经培养14天应无菌生长。

5.1.2 灵敏度：经培养对照管应无菌生长，试验管接菌小于100cfu均应生长良好。

5.2 微生物限度使用性检查5.2.1 细菌、霉菌和酵母菌计数检查取标准菌株大肠、金葡、枯草、白念、黑曲霉菌50～100cfu,分别接入于测试与对照培养基，经规定温度、时间培养，测试结果测试与对照培养基平均菌落数比不应小于70%。

5.2.2 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查取新鲜标准菌株大肠、金葡、铜绿假单胞菌制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养基进行促生长能力、抑制能力及指示能力测试，结果被测培养试验菌的生长反应情况与对照培养基一致。

（液体培养基应记录为生长良好/生长微弱/未生长；固体培养基应记录为符合xx菌特征/不符合xx菌特征）。

5.2.3 大肠埃希菌、大肠菌群检查取新鲜标准菌株大肠、金葡球菌制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养基进行促生长能力、抑制能力即指示能力测试，结果被测培养基试验菌的的生长反应情况应与对照培养基一致。

（液体培养基应记录为生长良好/生长微弱/未生长；固体培养基应记录为符合xx菌特征/不符合xx菌特征）。

5.2.4白色念珠菌、梭菌检查取新鲜标准菌株大肠、白念、生孢梭制备使成10～100cfu菌悬液，分别对测试与对照培养进行促生长能力、抑制能力及指示能力测试，结果被测培养基试验菌的生长反应情况应与对照培养基一致。

起草人Prepared by:起草日期Date:_____________________ QC审核人Reviewed by:审核日期Date:_____________________ QC审核人Reviewed by:审核日期Date: QA批准人Approved by:批准日期Date:质量部QD目的Purpose为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。

范围Scope本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。

职责Responsibility分析员：严格按照本操作规程执行。

及时完成各类相关记录。

在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。

主管：监督本操作规程的执行。

对检验员进行必要的培训。

指导任何可能的OOS和偏差调查。

内容procedure1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。

2试验用菌种及培养基2.1菌种:2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。

2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633]2.1.3大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739]2.1.4金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538]2.1.5白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231]2.1.6黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404]2.1.7伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028]2.1.8铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027]2.2培养基2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。

2.2.2大豆酪蛋白消化肉汤Soybean-Casein Digest Broth2.2.3大豆酪蛋白消化琼脂Soybean-Casein Digest Agar2.2.4沙氏葡萄糖琼脂Sabouraud Dextrose Agar2.2.5肠道菌增菌肉汤Enterobacteria Enrichment Broth Mossel2.2.6紫红色胆汁葡萄糖琼脂Violet Red Bile Glucose Agar2.2.7麦康凯肉汤MacConkey Broth2.2.8麦康凯琼脂MacConkey Agar2.2.9RV沙门氏菌富集肉汤Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth2.2.10木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂Xylose Lysine Deoxycholate Agar2.2.11甘露醇氯化钠琼脂培养基Mannitol Salt Agar2.3微生物计数培养基的适用性检查2.3.1微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

培养基适用性检查操作规程
1．目的：检查培养基对相关菌种的适用性，保证微生物实验结果的有效性。

2. 适用范围：适用于首次使用的培养基种类、购入的新批次培养基的适用性检查。

3. 依据：《中国药典》（2010版）四部：无菌检查法/微生物限度检查法-培养基的适用性检查
4. 职责：微生物检验员实施，QA监督。

5. 内容：
5.1 设备和材料
恒温培养箱、无菌培养皿/试管、接种环、酒精灯/火焰喷枪、超净工作台、＜100CFU/ml 的工作菌液、灭菌后的培养基（无菌检查用、计数用）
5.2 培养基适用性检查-无菌检查用
5.2.1 无菌性：
每种培养基每批随机抽取不少于10支，其中5支置30~35℃、另5支置20~25℃培养14天。

14天后均应无菌生长。

5.2.2 灵敏度
取培养基3支，其中2支接种相应的工作菌液各1ml，另1支不接种，作为空白对照，置30~35℃培养3天（或20~25℃培养5天）。

逐日观察结果。

空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则判定该培养基的灵敏度检查符合规定。

5.3 培养基适用性检查-计数用
取无菌培养皿，吸取相应的工作菌液各1ml注入无菌培养皿，立即倾注培养基，每株试验菌接种2个培养皿，混匀，凝固。

同时用对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

置30~35℃培养48小时（或23~28℃培养72小时），计数。

若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。

6.相关表格：《培养基适用性检查记录》。

培养基的适用性检查和方法适用性试验操作规程
培养基的适用性检查和方法适用性试验
操作规程
文件编号：
版本号：C/0 分发号：
受控状态：
编制部门：质管部
编制人: 日期：
审核人: 日期：
批准人: 日期：
发布实施
分发部门：□总经理□行政部□采购部□销售部□生产部□质管部□研发部□设备部□存档
管数从表3查被测供试品每1g或每1ml中需氧菌总数的最可能数。

6.3.5 结果判断计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；采用MPN法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。

若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。

培养基的适用性检查和方法适用性试验操作规程
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