第12章分子发光分析法
12.1.0发射光谱
物质通过电致激发、热致激发或光致激发等激发过程获得能量，变为激发态原子或分子M*，当从激发态过渡到低能态或基态时产生发射光谱，多余能量以光的形式发射出来：M*→M+hν
通过测量物质的发射光谱的波长和强度来进行定性和定量分析的方法叫做发射光谱分析法。
分子荧光和磷光分析法属于发射光谱法。
12.1.1分子荧光和磷光分析法
1.荧光和磷光的产生
1)Jablonski能级图
2)多重度：M=2s+1（s为电子自旋量子数的代数和，其值为0或1）
单重态（S）：分子中全部轨道里的电子自旋配对，即s=0，M=1
三重态（T）：电子在跃迁过程中自旋方向改变，分子中出现两个自旋不配对的电子，即s=1，M=3
三重态能级比相应单重态能级略低。
3)去活化：处在激发态的不稳定分子返回基态的过程。
振动弛豫：分子吸收光辐射后从基态的最低振动能级跃迁到激发态的较高振动能级，然后失活到该电子能级的最低振动能级上。
内转换：相同多重度等能态间的无辐射跃迁。
外转换（猝灭）：激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用导致能量转换而使荧光或磷光强度减弱或消失。
系间跨越：不同多重度等能态间的无辐射跃迁。
荧光发射：单重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。
磷光发射：三重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。
2.激发光谱和发射光谱及其特征
激发光谱：以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
发射光谱：以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
荧光发射光谱的特点：
1)Stokes位移：在溶液中，分子荧光的发射峰相比吸收峰位移到较长的波长。
2)荧光发射光谱与激发波长的选择无关。
3)镜像规则：荧光发射光谱和激发光谱镜像对称。
12.1.2荧光量子产率和分子结构的关系
荧光量子产率（荧光效率/量子效率）：表示物质发射荧光的能力，
荧光量子产率与分子结构的关系：
1.跃迁类型
物质吸收紫外-可见光发生π→π*或n→π*跃迁，然后经振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生π*→π或π*→n跃迁而产生荧光。
π*→π跃迁的量子效率较高。
2.共轭效应
绝大多数能产生荧光的物质含有芳香环或杂环。
具有共轭体系的芳香环或杂环化合物，环越多，电子共轭程度越大，产生荧光波长越长，荧光强度越大。
3.刚性平面结构
多数具有刚性平面结构的有机分子具有较强的荧光发射。
刚性结构可以减少分子振动，降低外转换的效率。
4.取代基效应
芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大影响。
1)增强荧光的取代基：给电子基团-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2、-CN等。
基团的n电子电子云与苯环上的π电子云共轭，增大共轭体系，使荧光波长红移，强度增强。
2)减弱荧光的取代基：吸电子基团-COOH、-COOR、-NO2、-NO、-SH、-C=O、卤素离子等。
荧光波长蓝移，强度减弱。
3)影响不明显的取代基：-NH3+、-SO3H、-R等。
4)重原子效应：芳环上被卤素取代后，系间跨越增强，磷光增强，荧光减弱。
其荧光强度
随卤素原子序数增加而减小，磷光强度相应增大。
12.1.3荧光（磷光）光谱仪
1.荧光光谱仪的主要部件
1)光源：卤钨灯、高压汞灯、氙弧灯、激光。
2)单色器：第一单色器选最佳激发波长，第二单色器选最佳荧光波长。
3)样品池：合成的熔融二氧化硅（无荧光发射，四面透光）。
4)检测器：光电倍增管（PMT）、光电池（PDA）、电荷耦合装置（CCD）。
2.磷光检测
1)室温固态样品（室温磷光，RTP），低温液态样品（低温磷光，LTP）。
2)脉冲光源（时间分辨技术）
12.1.4定量分析
1.定量分析的理论依据
2.影响荧光强度的因素
1)环境因素对荧光强度的影响
a.溶剂：溶剂的极性对分子的紫外吸收光谱有很大的影响，进而对荧光光谱有一定的影响。
b.温度：温度上升，外转换去活几率增大，荧光产率下降。
c.溶液pH：有机化合物酸形和碱形的荧光光谱和量子产率不同。
2)内滤光作用：当发光物质浓度增大时，校准工作曲线发生弯折，可能是由于内滤光作用
的影响。
a.激发光通过样品时每层样品都有吸收，使激发光强度减弱，从而减弱荧光强度。
b.自猝灭（浓度猝灭）：激发态分子将能量转移给其他分子。
c.自吸收：当Stokes位移很小以致吸收光谱的长波长端与发射光谱的短波长端重叠时，
一部分发射光会被溶液自身吸收。
3)散射光的影响
容器表面的散射、Tyndall散射、Rayleigh散射、Raman散射均使荧光空白值增加，灵敏度下降。
3.灵敏度和选择性
1)灵敏度的表示
a.（美国标准物质与测定⽅法）硫酸奎宁在0.05mol·L-1H2SO4溶液中的检出限。
b.纯⽔的Raman峰（模拟荧光）的信噪比。
c.检出限：刚好⾼于空白的样品测定⾄少10次以上读数，其标准偏差的3倍所对应的分
析物的浓度。
2)选择性
a.激发光波长
b.荧光测定波长
c.合适的体系
d.荧光寿命的差别
12.1.5荧光分析方法
1.直接荧光法：本身在紫外-可见光照射下可以发射荧光的化合物。
2.荧光衍生化方法
1)与金属离子络合：荧光试剂与金属离子螯合形成五元环或六元环螯合物。
2)有机分析中的无机探针：使新的发光物种在500nm以上有荧光发射，避免基体干扰。
3)非金属和阴离子的衍生化：测定B（与安息香缩合）、Se、氰化物、硫化物等。
4)有机物的衍生化：通过衍生化方法获得在长波长区发射荧光的产物。
3.荧光猝灭法
荧光物质发出的荧光被分析物猝灭，随被分析物浓度的增加，溶液的荧光强度降低。
根据Stern-Volmer方程，
12.1.6荧光分析技术的应用
1.无机化合物的分析
能直接产⽣荧光并应用于测定的为数不多，但通过有机配合物进⾏荧光分析的元
素达70多种，如：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀⼟元素。
以荧光猝灭法测定的离⼦有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等。
2.有机化合物的分析
脂肪族化合物本身能发荧光的很少，需与某些试剂反应后才能进⾏荧光分析。
芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光，可直接用荧光法测定。
荧光分析法可测定结构复杂的⼤量有机物，如：各种维⽣素、叶绿素、氨基酸、
蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等。
12.1.7荧光分析新技术
时间分辨荧光：应用脉冲激光光源测定荧光物质的寿命。
相分辨荧光：通过调节激发波的相位移，可测定多组分体系中各荧光物种的寿命。
偏振荧光：研究分子间的相互作用。
激光诱导荧光（LIF）：对分析物提供选择性激发，避免基体干扰，大幅提高灵敏度。
12.1.8磷光分析技术的应用
能产⽣磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到⼀定的应⽤。
低温磷光分析已应⽤在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析。
固体表⾯室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析⼿段。
12.1.9化学发光分析
1.优势：灵敏度⾼；线性范围宽（⼀般有5~6个数量级）；仪器设备简单，成本低廉；分析速度快，易实现⾃动化。
局限性：可供发光⽤的试剂有限；发光机理有待进⼀步研究。
2.基本原理
3.应用于分析化学的化学发光体系
鲁米诺（3-氨基苯⼆甲酰环肼）是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，产⽣化学发光反应时量⼦效率为0.01~0.05。
鲁米诺在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应⽣成最⼤波长为425nm的光辐射。
