小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)的研制
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1 鹅的雌雄鉴别一、**鉴别1.雏鹅期最佳览别期是在出雏后2~24小时以内,常用以下两种操作方法:(1)翻肛法此法较为广泛采用。
操作者用左手的中指和无名指夹住颈口,使其腹部向上,用右手的拇指和食指放在泄殖腔两侧,轻轻翻开泄殖腔,如在泄殖腔口见有螺旋形突起,即为公雏,如是三角瓣形皱褶,即为母雏。
(2)捏肛法左手握住雏鹅,以右手食指和无名指夹住雏鹅体侧,中指在其**外轻轻向上一顶,如感觉有一细小突起者,即为公雏,如无,则为母雏。
此法较难掌握,要求中指感觉灵敏,熟练掌握后,鉴别速度较快。
2.育成期(或半月龄以后) 此期用翻肛法鉴别较为准确。
具体操作如下:操作者呈半蹲伏,右膝压住鹅的背前部,稍用力(压住即可,不可用力过猛或将全身重量全部压在鹅身上,以免把鹅压伤),左、右手的大拇指、食指和中指共同操作,向后向下按压,翻开泄殖腔(此时鹅的腹压增大,只要注意用力技巧,较为容易翻开),如见有一0.6~0.8厘米长的细小突起(此为生长过程中的**),即为公鹅,如无,则力母鹅。
也有时操作者可将鹅放在膝盖上或操作台上翻肛鉴别,此法较为省力,但费时。
有的母鹅在泄殖腔边缘处有一三角形突起,这种鹅俗称“刺儿母鹅”,此时容易将其判断为公鹅,要注意区分,以免造成混淆,而影响鉴别率。
3.成鹅期至3~4月龄时公鹅的**已逐渐发育成熟,成熟的**长约6厘米,粗约1厘米,它是由一对左右纤维淋巴体组成,分基部和游离部(但有的鹅因饲养管理欠佳或营养不良时,**未成形,甚至有的与育雏期时相同)。
鉴别时,技术操作同育成期,手指微用力,**即可伸出。
正常的**弹性良好,比较容易伸出和回缩。
如见在其中部或根部有结节,则可能是患大肠杆菌病或其它疾病,可依据具体情况予以淘汰处理或治疗后继续留用。
如翻开泄殖腔,只见有雏形的皱襞,则为母鹅,经产母鹅则较为松弛,很容易翻开。
二.外形鉴别1.雏鹅期公雏和母雏在出雏时就存在着一些差异。
一般来说,雄雏体格较大,喙长宽,身较长,头较大,颈较长,站立的姿势较直;雌雏的体格较小,喙短而窄,身体形圆,腹部稍向下,站立的姿势稍斜。
第一章一、鸡原体病(Mycoplasma Gallisepticum)二、传染性鼻炎(Infection Corysa)三、鸡葡萄球菌病四、鸭传染性浆膜炎五、曲霉菌病(AA)(Avian Aspergillosis)六、沙门氏菌七、大肠杆菌八、巴氏杆菌九、亚利桑那菌病十、结核病十一、禽链球菌病十二、弯曲杆菌性肝炎十三、绿脓杆菌十四、肉毒中毒十五、鸡克雷伯氏杆菌病十六、鸭伪结核十七、衣原体病十八、坏死性肠炎十九、禽李氏杆菌病(禽单核细胞增多症)二十、家禽念珠菌病二一、溃疡性肠炎二二、鸡疏螺旋体病第二章一、鸡新城疫(Newcastle Disease, ND)二、传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis)(ILT)三、传染性支气管炎(Infection Bronchitis, IB)四、鸡马立克氏病(Marek’s Disease, MD)五、传染性法氏囊病(Infections Bursal Disease, IBD)六、禽白血病(ALL)七、禽流感八、禽脑脊髓炎(Avian Encephalo Myelitis,AE)九、禽腺病毒感染(Avian Adenovirus Infection)十、鸡传染性贫血(CIA)十一、鸭病毒性肝炎十二、小鹅瘟(Goossing plague,GP)十三、鸭瘟(Duck Plaqne,DP)十四、番鸭细小病毒病十五、呼肠孤病毒感染十六、禽痘十七、网状内皮增生病第三章:寄生虫病第一节原虫病一、鸡球虫病二、隐孢子虫病三、住白细胞虫病四、组织滴虫病五、禽疟原虫病六、住肉孢子虫病七、毛滴虫病八、六鞭原虫病第二节吸虫病第三节绦虫病第四节线虫病第五节棘头虫第六节体外寄生虫第四章营养缺乏、代谢病及中毒性疾病一、维生素A缺乏症二、维生素D缺乏症三、维生素E缺乏症四、维生素K缺乏症五、维生素B1缺乏症六、维生素B2缺乏症七、泛酸缺乏症八、胆碱缺乏症九、烟酸缺乏症十、维生素B6缺乏症十一、叶酸缺乏症十二、维生素B12缺乏症十三、生物素缺乏症十四、饲料中钙磷缺乏及比例失调十五、锰缺乏症十六、镁缺乏症十七、硒缺乏症十八、家禽痛风十九、鸡脂肪肝综合症二十、鸡脂肪肝和肾综合症二一、磺胺类药物中毒二二、呋喃类药物中毒二三、氯化钠中毒二四、黄曲霉毒素中毒二五、棉菜籽饼中毒二六、一氧化碳中毒二七、鸡肌胃糜烂病二八、禽的喹乙醇中毒第五章禽类的胚胎病及其防治第一节各种禽类的孵化期及孵化温度第二节胚胎病的研究方法第三节营养性胚胎病第四节传染性胚胎病第五节孵化制度不当引起的胚胎病第六节胚胎病的防治方法第六章其他第一节鸡肿头综合症第二节肉鸡腹水综合症第三节异食癖第四节家禽嗉囊炎(软嗉症)第七章禽病诊断禽传染病家禽细菌性传染病一、支原体病(Mycoplasma Gallisepticum) (MS)(MG)本节三个呼吸道病,特点:主要原因:概念本病英文简称MG,又叫慢性呼吸道病(CRD),简称慢呼(见教材P242),是由败血支原体引起的鸡和火鸡的一种慢性接触性呼吸道传染病,其临床特征为咳嗽、流鼻涕、呼吸困难、有罗音及面部肿胀。
一、名词解释传染(infection):病原微生物侵入动物机体,并在一定部位定居,生长繁殖,从而引起机体一系列病理反应的过程传染病(Infectious disease):由病原微生物引起,具有一定的潜伏期和临诊症状,并具有传染性的疾病持续性感染(persistent infection):指动物长期持续的感染状态慢病毒感染(chronic infection):又称长程感染,是指潜伏期长,发病呈进行性且最后常以死亡为转归的病毒感染。
疫源地:有传染源及其排出的病原体存在的地区。
传染源(Source of infection):只有某种病原体在其中寄居、生长、繁殖,并能排除体外的活的动物机体。
传染期:水平传播(horizontal transmission):传染病在群体之间或个体之间以水平形式横向平行传播。
垂直传播(vertical transmission):从亲代到其子代之间的纵向传播方式。
检疫:是指利用各种诊断和检测方法对动物及其相关产品和物品进行疫病、病原体或抗体检查。
预防性消毒:结合平时的饲养管理对畜舍、场地、用具和饮水等进行定期消毒,已达到预防传染病的目的。
临时消毒:在发生传染病时,为了及时消灭刚从传染源排出的病原体而采取的消毒措施。
终末消毒:在患病动物解除隔离、痊愈或死亡后,或者在疫区解除封锁之前,为了消灭疫区内可能残留的病原体而进行的全面彻底的大规模消毒。
紧急接种:在发生传染病时,为了迅速控制和扑灭疫情而对疫区和受威胁区尚未发病的动物进行的应急性计划外的免疫接种。
预防接种:在经常发生某些传染病的地区,或有某些传染病潜在的地区,或经常受到邻近地区某些传染病威胁的地区,为了防患于未然,在平时有计划地给健康动物进行的免疫接种。
免疫程序(vaccination program):指一定地区,养殖场或特定动物群体内传染病的流行状况、动物健康状况和不同疫苗特性,为特定动物群体制定的接种计划。
动物检疫试题一.选择题1、近20 多年来,我国动物传染病的防制取得了显著进展,1996年1月16 日,我国正式宣布消灭了下面哪个疫病(),这是继牛瘟之后在我国第二个消灭的动物传染病。
A .猪瘟B.鸡新城疫C.禽流感D.牛肺疫2、1956 年,在我国宣布消灭了第一个动物传染病是(),为我国近代兽医史谱写了光辉的一页。
A.猪瘟B.鸡新城疫C.牛瘟D.牛肺疫3. 在猪病防制中,我国研制的()疫苗是目前世界上公认的比较理想的猪病疫苗。
A. 猪蓝耳病B.猪瘟C. 猪流感D、猪伪狂犬病4. 我国第一个获批准的兽用基因工程菌苗是防制下面哪个疾病的?()A .猪大肠杆菌B.猪沙门氏菌C.猪副伤寒D. 猪痢疾5. 基因工程缺失疫苗在防制()中应用非常广泛,并且效果不错。
A. 猪瘟B.猪伪狂犬病C.猪流感D.猪蓝耳病6. ()是由我国科学家在国际上首次发现的家禽传染病。
A 小鹅瘟B.鸭瘟C.禽流感D.新城疫7.()是1984 年由我国首先发现的一种病毒性急性传染病,该病严重危害养兔业。
8. 1997 年经全国人大常委会通过的()已于1998年1月起正式实施,该法规是我国动物传染病防制工作的法律依据。
A 《家畜家禽防疫条例》B 《中华人民共和国进出境动物检疫法》C.《中华人民共和国动物防疫法》。
9.生物安全包括养殖生产中的疫病防控体系、实验室安全体系和()领域3个方面。
A. 生物技术B、基因芯片C、基因工程D.预防接种一、单项选择题1.发生可疑性炭疽后,应取()进行送检。
DA.肝脏、B.心脏、C.肺脏、D.耳朵或天然孔渗出血2.急性猪肺疫的特征性病变是()AA.纤维素性肺炎、B.坏死性肠炎、C.脾肿大,边缘梗死、D.坏死性肝炎3.生产上一般采用()进行布病的检疫BA.琼扩试验、B.试管或平板血清凝集试验、C.中和试验、D.ELISA4.猪丹毒主要发生于()BA.仔猪、B.架子猪、C.怀孕后期母猪、D.香猪5 猪喘气病是由()引起DA.猪喘气病病毒、B.猪丹毒杆菌、C.衣原体、D.猪肺炎支原体6.牛流行热又称()AA.三日热或辐射热、B.五日热、C.七日热、D.无高热7.破伤风是由()引起CA.魏氏梭菌、B.溶血梭菌、C.强直梭菌、D.巴氏杆菌动物传染病及防疫试题库(10+1>12 套)与答案8.大肠杆菌有()血清型DA.1 个、B.2个、C.3个、D.多个9.猪伪狂犬病侵入一个猪场后,往往难以彻底根除,其根本原因是()B A.病毒毒力太强、B.动物健康带毒、C.病毒对外界环境抵抗力太强、D.病毒可通过飞沫传播10.仔猪水肿病的特征病变为()DA.坏死性肠炎、B.虎斑心、C.雀斑肾、D.胃壁和其他某些部位水肿11.()又称“唢吼风” AA.最急性型猪肺疫、B.最急性型猪喘气病、C.最急性型猪瘟、D.最急性型猪伤寒12.对结核病进行检疫常采用()BA.沉淀反应、B.变态反应、C.补体结合试验、D.平板凝集13.莱姆病的病原为()DA.支原体、B.衣原体、C.立克次氏体、D.伯氏疏螺旋体14.虎斑心是()的特征性病变DA.伪狂犬病、B.猪伤寒、C.牛结核、D.口蹄疫15.( )又称“恐水症” BA.伪狂犬病、B.狂犬病、C.布氏杆菌病、D.犬瘟热16.在所有种类的抗体中,()是机体抗感染的主力军。
鹅细小病毒VP3与禽分枝杆菌副结核亚种hsp65融合基因真核表达载体的构建及鉴定张岩;姜秀云;马红霞;高云航;徐凤宇【摘要】为了构建鹅细小病毒(GPV)的VP3与禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的hsp65融合基因重组真核表达载体,试验克隆了VP3和hsp65基因,并将二者先后插入真核表达载体pVAX1中,构建重组质粒pVAXl-VP3和pVAXl-hsp65-VP3.酶切和PCR鉴定表明表达载体构建正确,用脂质体将二者分别转染入Vero细胞中,间接免疫荧光检测其在细胞中的表达.结果显示,转染细胞表面可见绿色荧光,说明hsp65、VP3基因表达成功.试验为GPV的DNA疫苗研制及hsp65分子佐剂在动物医学中的应用奠定基础.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2013(047)005【总页数】4页(P6-9)【关键词】鹅细小病毒;VP3;hsp65;基因表达【作者】张岩;姜秀云;马红霞;高云航;徐凤宇【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,长春130118 ;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,长春130118;吉林农业大学生命科学学院,长春130118;吉林农业大学动物科技学院,长春130118 ;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,长春130118;吉林农业大学动物科技学院,长春130118 ;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,长春130118;吉林农业大学动物科技学院,长春130118 ;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)引起的1月龄以内雏鹅急性或亚急性败血性传染病,发病率和致死率高,是危害养鹅业的重要传染病之一,被我国列为二类动物疫病。
目前,主要采用弱毒苗在产蛋前接种母鹅以及雏鹅肌注高免血清防控该病,但弱毒疫苗存在潜在返祖风险[1]。
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2012年3月(上)收稿日期:2011-05-09;修回日期:2012-01-29基金项目:吉林省科技厅发展计划项目(20040206-2-2)作者简介:蒋运博(1985-),女,硕士研究生,bobo_jyb@163.com.通信作者:胡桂学(1963-),男,教授,博士,huguixue901103@163.com.鹅细小病毒的分子生物学研究进展蒋运博,董浩,马磊,徐楠楠,段小波,胡桂学(吉林农业大学动物科技学院,长春130118)中图分类号:S852.65+9.2文献标识码:A文章编号:1004-7034(2012)03-0031-03关键词:鹅细小病毒;分子生物学;小鹅瘟摘要:鹅细小病毒(GPV )病是危害养鹅业的主要传染病之一。
文章根据国内外对鹅细小病毒的分类地位、分子生物学特性、基因组的结构特点、非结构蛋白与结构蛋白的功能以及分子生物学诊断与防治等方面的研究作一综述,以期为鹅细小病毒及小鹅瘟的防控提供参考。
小鹅瘟是由鹅细小病毒(goose parvovirus ,GPV )引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病。
该病主要侵害3 20日龄的雏鹅和雏番鸭,以渗出性肠炎、小肠黏膜表层大面积坏死脱落、肠道栓塞为特征性病变,是一种主要侵害肠、肝脏、肾脏、心脏等实质脏器的急性、高度接触性传染病。
1956年,小鹅瘟病毒首次由中国学者方定一在江苏扬州市发现并分离,是一类无囊膜的DNA 病毒。
1974年,国际禽病学会(WPSA )将其命名为Derzsys 氏病。
近年来,许多国内外学者从不同角度,对鹅细小病毒进行了分子水平上的研究,更好地认识了鹅细小病毒的生物学特性,促进了对该病的有效防制,文章仅对鹅细小病毒分子生物学方面的研究进展作一综述。
1分类地位及一般特性鹅细小病毒属于细小病毒科细小病毒亚科细小病毒属成员,国际病毒分类委员会将细小病毒科分为2个亚科,即细小病毒亚科和浓核病毒亚科,细小病毒亚科又分为细小病毒属、红病毒属和依赖病毒属。
鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达张颖;鲁承;赵文婧;陈海迪;高旭【摘要】为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)012【总页数】3页(P23-25)【关键词】鹅细小病毒;VP3基因;真核表达【作者】张颖;鲁承;赵文婧;陈海迪;高旭【作者单位】延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133000【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2鹅细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)引起的主要侵害4日龄~20日龄雏鹅的一种病毒性传染病,该病病程短,传染性强,病死率高,给养鹅业造成了严重的危害[1-3]。
该病毒由我国学者方定一于1956年在江苏扬州首次发现。
研究发现VP3基因是GPV核衣壳的主要成分,约占总蛋白含量的80%,具有较高的保守性,能够诱导机体产生中和抗体,是GPV的主要保护性抗原[4-5]。
本研究拟以本课题组前期分离的延边株(YBLJ)鹅细小病毒为毒株,克隆VP3基因和构建真核表达载体,并研究GPV的VP3基因在Vero细胞中表达情况,为进一步研制GPV的VP3基因核酸疫苗奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒、菌种 GPV(YBLJ株)为本实验室从延边某养鹅场发生鹅细小病毒病的病死鹅脾脏中分离得到。
43不同方法灭活卵黄抗体的比较试验孙心,梁宛楠,姜宇(哈药集团生物疫苗有限公司 哈尔滨 150040)doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2018.08.024摘要:为确保提取卵黄抗体的安全性,防止其中混入外源病毒,为此使用了化学药品灭活的方法。
试验对不同终浓度的甲醛和二乙烯亚胺(BEI)对卵黄抗体灭活效果进行了比对。
将鸡新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV H9型)、禽传染性囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDS-76)和禽脑脊髓炎病毒(AEV)分别混入到卵黄抗体中,混合后加入终浓度为0.03%、0.05%、0.1%甲醛和0.02%BEI于室温条件下,灭活24h,从试验结果我们可以看出0.02%BEI和0.03%甲醛只能灭活部分病毒,而0.05%和0.1%甲醛能灭活全部病毒,并且对抗体活性无任何影响。
因此,综合以上结果选用0.05%的甲醛进行灭活,保证疫苗的安全性。
关键词:灭活;卵黄抗体;BEI;甲醛在制备抗小鹅瘟卵黄抗体时,应选择健康的产蛋母鸡,按一定的免疫程序接种小鹅瘟抗原,获得高免鸡蛋。
试验过程中的免疫鸡群,虽然经过一系列的挑选及其它疫病的免疫,但是还是存在某些病毒的感染,对卵黄抗体的安全性有很大的影响。
因此本试验选用甲醛和二乙亚胺(BEI)两种灭活剂进行试验。
在卵黄抗体中加入甲醛溶液终浓度分别为0.03%、0.05%和0.1%,BEI 的终浓度为0.02%,通过试验比对从中选出最适宜的灭活剂浓度。
1 材料和方法1.1 材料病毒:小鹅瘟病毒、禽流感病毒(H9)、鸡新城疫病毒(Ⅰ株)、禽传染性囊病病毒(B87株)、减蛋公司综合征病毒(EDS-76株)均为研发中心繁殖;禽脑脊髓炎病毒(Van Roekel 株)购自中监所。
化学试剂:甲醛溶液(天津,AR)、BEI(瑞士)。
SPF 种蛋:哈药集团生物疫苗有限公司SPF 鸡场;SPF 鸭蛋:哈尔滨兽医研究所。
1.2 试验方法1.2.1 抗体制备 参照制定的工艺规程制备小鹅瘟卵黄抗体。
小鹅和小鸡防疫方案一用小鹅瘟活疫苗。
种鹅未经小鹅瘟活疫苗免疫,或经小鹅瘟活疫苗免疫,但时间已超过100天,这类种鹅产的蛋孵出的雏鹅,在出壳后1~2天用小鹅瘟活疫苗1羽份皮下注射免疫,7天后产生免疫力。
免疫种鹅在免疫后100天内产的蛋孵出的雏鹅有母源抗体,不要用活疫苗免疫,以免母源抗体中和活疫苗中的病毒,导致免疫失败。
二用小鹅瘟抗血清。
在无小鹅瘟流行地区,可在雏鹅1~7日龄时用同源(鹅制)抗血清,每只皮下注射0.5毫升;在小鹅瘟流行地区,在雏鹅1~3日龄时用上述血清每只注射0.7毫升。
三用鹅副黏病毒灭活疫苗、鹅流感灭活疫苗或鹅副黏病毒鹅流感二联灭活疫苗。
未经单苗或二联苗免疫,或免疫时间已超过2个月的种鹅产的蛋孵出的雏鹅,如当地无鹅副黏病毒病、鹅流感,可在雏鹅10~15日龄时进行I号剂型单苗或I号剂型二联苗皮下注射;如当地有这两种病,应在5~7日龄时进行Ⅱ号剂型单苗或Ⅱ号剂型二联苗皮下注射。
经单苗或二联苗免疫2个月以内种鹅的后代雏鹅,可在10~15日龄时进行I号剂型单苗或I号剂型二联苗免疫。
子鹅雏鹅经鹅副黏病毒灭活疫苗、鹅流感灭活疫苗或鹅副黏病毒鹅流感二联灭活疫苗免疫后45~60天,须进行第二次单苗或二联苗免疫,适当加大剂量,每只肌肉注射0.7~1毫升。
后备种鹅3月龄左右用小鹅瘟活疫苗免疫1次,按常规量注射。
成年鹅在鹅群产蛋前5天左右进行小鹅瘟活疫苗免疫,如子鹅已免疫过,可用常规4~5倍剂量进行第二次免疫,免疫期为4~5个月。
如子鹅没免疫过,按常规量免疫,免疫期为100天。
免疫后100~120天再用2~5羽份剂量免疫1次。
在鹅群产蛋前10天左右,肌肉注射I号剂型鹅副黏病毒灭活疫苗、鹅流感灭活疫苗,每只鹅注射1毫升,2个月后再注射1次。
一、鸡的防疫方案1日龄----马立克氏疫苗在鸡苗还没离开孵化场之前的24小时以内,使用Ⅲ型HVT疫苗进行皮下注射接种。
因为此疫苗需要冷藏,所以疫苗稀释后仍要装在冰瓶内,并且在2小时内用完。
小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)的研制
小鹅瘟是导致雏鹅死亡的常见疾病之一,可造成巨大经济损失,严重危害养鹅业的发展。
现有弱毒活疫苗和小鹅瘟抗体的广泛应用,在我国小鹅瘟疫病防控过程中发挥了巨大的作用。
但活毒疫苗存在毒力返强的潜在危害,从而限制了其生产应用,因此研究小鹅瘟灭活疫苗显得尤为重要。
本研究对小鹅瘟分离毒株的生物学特性进行了系统研究,筛选出免疫原性好、繁殖滴度高的小鹅瘟野毒株作为灭活疫苗候选株,并开展了生产工艺、乳化工艺和免疫效力研究工作,以期制备出安全、高效的小鹅瘟灭活疫苗,为我国小鹅瘟疫病的防控和净化提供有力工具。
1、小鹅瘟病毒疫苗候选株的筛选为了研制与当前小鹅瘟流行株匹配的疫苗,本研究对从2009~2011年江苏省养鹅地区疑似小鹅瘟的临床样品中共分离了 5株鹅细小病毒(GPV),同时对分离株进行VP3基因测序并绘制遗传进化树,序列分析结果表明GPV分离株与国内大部分分离株属于同一分支,明显不同于国内疫苗株SY61和台湾主要分支。
对获得的毒株经有限稀释法纯化,并对纯化后的病毒进行繁殖性能、毒力、特异性及免疫原性等进行了测定,5株病毒均属于强毒株,其中 Gosling plague virus/taizhou/10(TZ10)株病毒含量最高(F10
代:105.0ELD50/0.2ml以上),且其灭活抗原免疫鹅4周后的抗体水平最高,因此确定以TZ10株作为小鹅瘟疫苗候选株。
按照农业部颁发的《兽用生物制品(毒、虫)种种子批建立实验技术指导原则》各项要求,对纯化后的TZ10株F0代毒在鹅胚中连续传至30代,并分别对不同代次种毒进行了 AGP、鹅胚半数致死量(ELD50)测定、免疫原性、特异性实验及纯净性检验,建立了符合规定的小鹅瘟病毒TZ10株的基础种子批(F16~F20种毒)、
规定了生产用最高限制代次(F25)。
2、小鹅瘟灭活疫苗生产工艺研究疫苗生产过程中,抗原的生产工艺决定了疫苗质量及生产成本,抗原的完全灭活和疫苗的乳化工艺分别是关系到疫苗安全、有效性和疫苗质量的关键步骤。
本研究选取前期种子批F25代次GPV尿囊液,进行最佳鹅胚接种剂量与最佳鹅胚接种日龄的试验,从鹅胚死亡数统计、抗原收获量统计、病毒含量测定三方面进行比较,分别确定生产过程中最佳病毒稀释比例、接毒剂量、鹅胚日龄为:种毒用灭菌生理盐水进行1:100倍稀释,0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚最佳。
根据接种后不同时间鹅胚死亡数、抗原收获量、死亡鹅胚情况和病毒含量测定数据确定种毒最佳培养时间为接毒后48~120小时,收获死亡鹅胚尿囊液;抗原最佳培养时间为接毒后48~144小时,收获死亡鹅胚尿囊液及鹅胚。
为了确定抗原灭活的最佳方法,对甲醛溶液的浓度、灭活时间进行了研究,结果表明:采用甲醛溶液作为灭活剂,灭活剂终浓度为0.2%,37℃灭活48小时,可以完全灭活小鹅瘟病毒TZ10株。
乳化工艺研究证实:取小鹅瘟病毒TZ10株灭活抗原,按每96份抗原加4份灭菌吐温-80比例加吐温-80,充分溶解混匀,制成水相;94份注射用白油加6份司盘-80及1份硬脂酸铝,加热溶解至透明灭菌,制成油相;水相与油相的最佳配比为1:3,二次乳化的剪切速率在3000~4000r/min,乳化过程温度控制在25℃以下,可获得最佳乳化效果。
3、小鹅瘟灭活疫苗的安全性评价按照确定的小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)生产工艺,在实验室试制了 3批灭活疫苗。
将试制的3批小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)通过疫苗单剂量、单剂量重复及双倍剂量免疫3~5日龄、1月龄鹅、7月龄开产种鹅、9月龄产蛋种鹅进行安全性评价,结果表明:所有免疫鹅精神状态、采食、饮水正常,无全身不良反应。
接种部位无肿胀,免疫21日后,单剂量重复和双倍剂量接种的实验组中,有少量疫苗颗粒未吸收现象;除双倍剂量接种组个别鹅注射部位肌肉有轻微潮红外,其余各免疫组免疫鹅注射部位无异常变化。
免疫21日后,免疫组与对照组鹅平均增重无显著差异。
疫苗注射后1周内产蛋鹅产蛋数较对照组少2~3枚,之后恢复正常,且种蛋孵化率无差异。
表明研制的小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)对产蛋鹅安全,雏鹅接种后未出现任何临床症状。
4、小鹅瘟灭活疫苗的效力评价通过对3批试制疫苗的免疫效力试验,发现小鹅瘟疫苗免疫种鹅产生的GPV血清琼扩抗体水平与雏鹅被动免疫GPV琼扩抗体水平、攻毒保护率呈正相关;对种鹅血清GPV琼扩抗体效价与对应雏鹅攻毒保护结果相关性分析表明,当种鹅血清抗体效价为1:2时,雏鹅血清被动免疫保护率为92.3%;当种鹅血清抗体效价不低于1:4时,雏鹅被动免疫保护率达到100%。
考虑到临床饲养环境及鹅群健康状况的不确定性,规定疫苗的效力检验标准为:7~8月龄健康阴性鹅,胸部肌肉注射疫苗,1.0ml/只,4周后其血清GPV琼扩抗体效价几何平均值应不低于1:8。
最小免疫剂量实验结果表明,试制的3批疫苗以不低于0.5ml/只剂量免疫7~8月龄产蛋种鹅,免疫后种蛋孵化的雏鹅90%以上可以抵抗GPV强毒的攻击。
根据3批试制疫苗制苗抗原灭活前的病毒含量及最小免疫剂量试验结果,考虑到临床实际情况的复杂性,为保证雏鹅获得确实的被动保护,规定制苗用半成品抗原的病毒含量应≥105.5ELD50/0.2ml、推荐免疫剂量为1.0ml/只。
根据3批试制疫苗免疫持续期的种鹅和雏鹅的血清AGP抗体效价及所产种蛋孵化雏鹅的攻毒保护试验结果,确定种鹅开产前免疫2次,lml/次,其免疫持续期
为5个月;推荐免疫程序为:种鹅开产前5周首免,胸部肌肉注射,1.0ml/只,3周后以相同剂量、途径加强免疫1次。
该免疫程序可基本保证种鹅在6个月产蛋期内,雏鹅获得有效母源抗体抵抗GPV感染。
因健康阴性产蛋种鹅的来源和质量不够稳定,其作为效检用动物时,难以保证检验结果的稳定性及可重复性。
为此本研究对疫苗免疫SPF鸡后血清抗体效价及特异性进行了分析,以探讨其作为小鹅瘟疫苗效检替代动物的可行性。
3批小鹅瘟灭活疫苗以不同剂量免疫21日龄SPF鸡,抗体检测结果显示同一剂量不同时间点检测的SPF鸡血清AGP抗体效价基本一致,表明SPF鸡对疫苗可产生稳定的免疫抗体反应。
将SPF鸡免疫后阳性血清与小鹅瘟病毒进行中和反应结果表明,SPF鸡免疫小鹅瘟灭活疫苗后产生的抗体具有特异性;抗体效价随免疫剂量和时间的变化规律与7~8月龄健康阴性种鹅免疫后血清AGP抗体效价的变化规律一致,证明免疫SP F鸡后测定血清AGP抗体效价方法作为小鹅瘟灭活疫苗的效检方法是可行的。
根据疫苗免疫SPF鸡和种鹅的中和抗体效价与AGP抗体效价相关性分析,当种鹅AGP抗体效价在1:8时,中和抗体效价为2.87log10,对应的SPF鸡血清AGP 抗体效价为1:16;根据免疫剂量与抗体产生的正相关关系,及实验动物对疫苗的吸收情况,确定21日龄SPF鸡作为小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)效力检验替代动物的检验标准为:21日龄SPF鸡,颈部皮下注射,0.25m]/只,免后4周小鹅瘟AGP抗体效价的几何平均值应不低于1:18。