氨基酸、多肽和蛋白质
1 氨基酸
1.1 结构特征
●标准氨基酸：至少有一羧基（carboxyl）和一氨基连接在同一个碳原子上（该碳原子称为α-
碳原子）。
●注意，脯氨酸含亚氨基。
●构成蛋白质的氨基酸是20种标准氨基酸（可能含有非标准氨基酸，标准氨基酸经修饰而形
成的）。
最近又发现了两种标准氨基酸。
●标准氨基酸中，1806年发现第一种氨基酸——天冬酰胺，1938年发现最后一种——苏氨酸。
●α-碳采用sp3杂化，键角109.5°。
●α-碳是手性中心（大多数情况下，只有α-碳是手性中心；甘氨酸无手性，因R基为H）。
其
绝对构型采用D,L系统，建立在L-甘油醛（L-glyceraldehydes）和D-甘油醛的结构之上。
●D、L构型与其实际的旋光性无关。
●到目前为止在蛋白质中发现的氨基酸都是L的（酶的活性位点是不对称的，即酶促反应是在
手性环境下进行的），D仅存在于细菌细胞壁上的短肽和抗生素小肽。
1.2 分类
●非标准氨基酸是标准氨基酸的衍生物（derivative）。
●根据R基的不同性质将氨基酸进行分类，按其极性或在生理pH（近7.0）下与水相互作用
的趋势分为5类：非极性脂肪族、芳香族、极性不带电、带正电（碱性）、带负电（酸性）。
●非极性脂肪族：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸。
（衣架凉鞋饼干
＝异亮、甲硫、亮、缬、丙、甘）
●芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
（食老本（粤语）＝色、酪、苯丙）
●极性不带电：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺。
（诗书伴琴谱＝
丝、书、半胱、脯；天冻先安谷＝天冬、酰胺、谷）
●带正电：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
（组队来京晋见＝组、赖、精、碱性）
●带负电：天冬氨酸、谷氨酸。
（天上的谷子很酸＝天、谷、酸性、都是氨酸）
●酪氨酸苯环上有羟基；丝氨酸和苏氨酸有羟基；半胱氨酸有巯基可成对形成二硫键；组氨酸
是唯一一个具接近的pK a值电离侧链的氨基酸，常作为质子供体和受体；天冬氨酸和谷氨酸都有两个羧基。
●含芳香族R基的氨基酸能强烈吸收紫外光，使许多蛋白质在280nm处有特征性强烈吸收。
1.3 化学属性
1.3.1滴定曲线（titration curves）
●氨基酸是两性物质。
脱氢时先脱羧基再脱氨基。
对于含单一α-羧基、α-氨基和不离子化的氨
基酸而言，羧基脱氢后氨基脱氢前为等电点（isoelectric point）。
pI＝（pK1＋pK2）/2
●只有组氨酸的R基（pK a＝6.0）在中性pH下提供显著缓冲能力。
●所有非末端残基的α-羧基、α-氨基共价形成了肽键，不发生离子化，对于多肽总的酸碱行为
无贡献。
1.3.2特征反应
●茚三酮能使氨基酸显蓝色（脯氨酸显黄色）
1.4 分离
●可用离子交换层析
2 肽与蛋白质
2.1 氨基酸链
●脱水缩合反应（condensation reaction）的自由能差为5kcal/mol，但无法自发进行。
在标
准生化条件下，平衡有利于向反应物移动。
为使反应在热力学上更为有利，羧基必须被化学修饰或活化，使羟基更易离去。
●肽键极稳定（虽水解时放能，但活化能高），在无催化剂存在的水溶液中可维持1000年，
在大多数细胞内环境下半衰期为7年。
●一般认为，少于50个氨基酸缩合成肽称寡肽，50～100个的称多肽（或相对分子质量低于
10000）
●20种标准氨基酸的平均分子质量为138，但在蛋白质中，小分子量氨基酸在数量上占优势，
平均下来为128，脱水缩合时再脱去一分子水的18，剩下110。
●缩合时是从N-端开始的，因此在书写时习惯将N-端放在左边。
●短肽可构成神经递质、激素、抗生素等。
2.2 辅基
●有些蛋白质除了氨基酸之外还含有其它永久连接的基团（辅基，可以不止有一个），这样的
蛋白称结合蛋白。
辅基可以是脂类、糖类、金属等。
●脱去辅基的蛋白称apoprotein（脱辅基蛋白）
2.3 物种间的蛋白同源性
●在不同物种中，氨基酸序列的一些特定位置总被相同的残基占据，这些残基称不变残基。
而
另外一些位置则表现出可变性，这些残基称可变残基。
●某些位置的替换大多发生在类似的残基间，称为保守替换。
3 蛋白质的处理
3.1 分离和纯化
●根据蛋白质的溶解性、分子量、带电性、亲和性（binding affinity）的不同，可分离、纯化
蛋白。
柱层析就是利用这个原理来做的。
高效液相层析（HPLC）利用高压泵加速蛋白质分子沿着柱子向下运动，通过减少过柱时间，可限制蛋白质条带的扩散，提高分辨率。
●分离纯化的一般步骤：组织→匀浆（homogenization）→过滤（filtration）→粗提取（crude
extract）→盐析（salting out）↔离心（centrifugation）→透析（dialysis）→柱层析（column chromatography）
●盐析常用硫酸铵，因其具有高度水溶性。
可用透析法去除硫酸铵。
●分离纯化时，一般先选择廉价、简单的程序再选择昂贵、复杂的程序。
●离子交换层析（ion-exchange chromatography）：利用一定pH下不同蛋白质带电的种类和
电量存在差异，与柱介质上的离子结合力不同来做的。
柱有阴、阳离子交换树脂两种。
●大小排阻层析（size-exclusion chromatography）：又称凝胶过滤（gel-filtration），柱介质有
选择孔径的聚合物。
大的蛋白质比小的蛋白质走得快（因小蛋白可以钻小孔，路径曲折）。
●亲和层析（affinity chromatography）：通过结合特异性来分离蛋白质。
柱介质上含有配体能
特异性结合某些蛋白。
●疏水相互作用层析（hydrophobic interaction chromatography）：根据不同蛋白质的疏水性
的强弱来做的。
溶液中高离子强度可增强蛋白质与疏水性柱介质之间的疏水作用，线性或阶段降低离子强度可选择性地将样品解吸。
3.2 电泳（electrophoresis）
●蛋白质电泳普遍在聚丙烯酰胺凝胶中进行。
大体上按照蛋白质的荷质比来移动，蛋白质的形
状对移动也有影响。
V Z
E f
μ=====
泳动速度净电荷
电泳移动性
电势摩擦系数
●十二烷基磺酸钠电泳（SDS-PAGE）常用来估测蛋白质的纯度和分子量。
SDS结合蛋白质
的量基本与分子量成正比，结合的SDS提供大量负电荷使蛋白本身的电荷不明显，使荷质比相同，同时也改变蛋白质的构象呈相同的形状，于是移动性完全由质量来决定（小蛋白比较快）。
电泳后再用考马斯亮蓝（与蛋白结合而不与胶结合）染色。
若蛋白含有亚基，则会被分开形成各个亚基的条带。
●等点聚焦电泳（IEF）用来确定蛋白质的等电点。
通过低分子量的有机酸碱混合物在外加电
场的凝胶中分布形成一个pH梯度。
于是蛋白质会移动到与pI相等的pH处停下。
●双向电泳结合等点聚焦和SDS电泳，能提高分辨率。
可分离相同分子量而等电点不同的蛋
白质，或相同等电点而分子量不同的蛋白质。
●电泳一般不用于纯化大量蛋白质，因电泳对蛋白质结构不利。
3.3 测序（sequencing）
●测序的一般步骤：分析氨基酸组分→打开二硫键（disulfide bond）→切割长肽为短肽→短肽
测序→短肽排序→定位二硫键。
●分析氨基酸组分：将肽链彻底水解（6mol/L HCl，110℃，24h），后用离子交换层析（或HPLC）
分离，后根据吸收峰来确定组分和含量。
●打开二硫键：可用过甲酸来氧化断键，或用二硫苏糖醇还原断键再用碘乙酸来乙酰化防止再
度形成二硫键。
●肽链切割：用溴化氰或蛋白酶来切割。
胰蛋白酶切Lys，Arg（C）；胰凝乳蛋白酶切Phe，
Trp，Tyr（C）；胃蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（N）；溴化氰切Met（C）。
●短肽测序：Edman法。
●短肽排序：比较多套片断，推理得出原来的完整序列。
●定位二硫键：将原来的蛋白样品作同样切割但不打开二硫键，然后电泳比较，比较条带即可
知道二硫键所在区域。
●现在很多氨基酸序列是通过分析其DNA序列来确定的。
3.4 化学合成
●含150个氨基酸残基的短肽可被化学合成。
●化学合成的速率远低于生物合成。
3.5 质谱法（mass spectrometry）
●省略……自己看书去……。
