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《腺病毒基因工程的实验方法学》实验手册华中科技大学基础医学院病原生物学系2014年3月课程目的：向基础、预防、药学和临床专业，从事新药和疫苗研究、基因治疗和疾病致病机制研究的研究生传授最适用的实验方法和技术。
课程特点：以重组腺病毒技术建立实验技术平台，选课学员可全面掌握病毒基因工程技术原理和重组腺病毒基因工程技术，并了解SFDA对相关技术产品的政策要求，从基础到临床应用的综合、系统角度考虑和设计科研课题，有的放矢地进行实战培训，为进入科研提前做好相关准备。
课程设计：强调跨学科技术的综合性学习（涉及微生物学、病毒学、分子生物学、细胞生物学）强调基础研究与临床实践。
开课方式：理论讲授和实践操作相结合。
利用微生物学室的科研条件（师资、场地、仪器设备、药品试剂等），完全按正式的科研要求进行严格训练。
背景介绍《腺病毒基因工程的实验方法学》课程包含的不同种类病毒载体和及其多样性的转基因技术原理。
不同种类病毒载体可分为三类：一、质粒型载体（含病毒复制子的真核细胞表达质粒，可经物理或化学方法转染细胞后并在细胞中复制或表达，不产生感染性病毒颗粒）。
二、假型病毒载体（含有病毒复制子和病毒包装所必需的顺式作用序列的质粒，转染提供病毒反式作用序列的细胞或在辅助病毒感染细胞的情况下，可被包装成与亲代病毒外形一致、但核酸特点不同的假型病毒，具有的感染性而缺乏复制能力）。
三、重组型病毒载体（将外源基因的表达盒插入到携带病毒非必需功能基因片断的转移载体中，转染野生型病毒感染的细胞并同源重组、或直接体外基因操作将外源基因的表达盒插入到野生型病毒基因组中的特定位置，获得经过修饰的病毒基因组在细胞内表达和复制，产生具有新遗传性状的感染性病毒颗粒）。
本课程的的实践教学内容，以构建和鉴定表达颗粒溶素的复制缺陷型重组腺病毒的内容为基础，进行举例并实践其中涉及的相关内容。
本实验构建的复制缺陷型重组腺病毒属于上述假型病毒载体。
具体原理参见教材，宏观上分为以下步骤，在本课程将这些步骤中涉及的技术和实验，分别集中进行在不同专题进行实验。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
硕士研究生基因操作实验技术实验讲义实验简介：本实验的目的是将嗜热脂肪芽孢杆菌AS 1411的淀粉酶结构基因（全长1.4kb）采用PCR方法扩增后接入大肠杆菌表达载体pLac18，构建成重组载体pLac18-amy，重组载体再转化大肠杆菌JM109，重组大肠杆菌可以在IPTG 的诱导下表达出耐热α-淀粉酶活性。
通过本实验的训练使学生在DNA重组，基因高表达方面得到全面的训练并加深对lac操纵子的理解。
实验一质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定1.1 实验材料LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LLB培养基II ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L，Glucose 5 g/L质粒小量快速提取试剂盒（由北京博大泰克公司赞助）含质粒pLac18的大肠杆菌JM109台式高速离心机‘水浴锅1.2 用硅胶膜分离法小量提取质粒这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。
用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开。
硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。
质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。
所有试剂均由试剂盒配套①接种重组大肠杆菌一环于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
②取1.5 ml离心管，倒入约1.5 ml菌液。
基因工程综合实验操作大肠杆菌常规培养大肠杆菌在LB（Luria–Bertani）液体培养基中，37℃水浴摇床培养12-16小时。
在LB固体培养基中，置于37℃培养箱培养12-16小时。
如果培养用于提取具有氨苄青霉素（Amp）抗性基因质粒（如pUC18）的菌体，则需在培养基中加入100 mg/ml的氨苄青霉素。
在重组子克隆的鉴定培养中，LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷（X-gal），浓度为40 mg/ml，以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG），浓度为50 mg/ml。
大肠杆菌染色体DNA的抽提1. 大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4℃，离心10分钟收获菌体沉淀。
2. 沉淀中加入3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。
3. 加入400 ml 10% SDS使最终浓度为1%，混匀，37℃保温30分钟或澄清即可。
4. 加入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60℃保温60分钟。
5. 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。
6. 4℃，15 000 rpm，离心30min。
7. 取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4℃，15000 rpm，离心30分钟。
8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4℃，离心10分钟。
9. 取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上，4℃，15000 rpm，离心30分钟。
10. 弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4℃，15000 rpm，离心5分钟。
11. 弃上清，沉淀于37℃凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。
12. 取5 ml电泳。
基因实验操作与安全知识的培训课程1. 课程介绍基因实验操作与安全知识的培训课程主要目的是为研究人员提供有关基因实验操作的基本知识和技能，以及实验室安全的基本原则和实践本课程将涵盖基因实验的基本步骤，包括基因的提取、纯化、扩增和分析，以及实验室安全的关键方面，包括个人防护、生物安全和化学安全2. 课程内容2.1 基因实验操作2.1.1 基因提取和纯化•实验原理和方法•实验步骤和操作技巧•实验结果的分析和解释2.1.2 基因扩增•PCR原理和操作步骤•扩增产物的分析和验证•扩增过程中的问题和解决方法2.1.3 基因分析•电泳分离和鉴定基因•序列分析和比对•表达分析和功能验证2.2 实验室安全2.2.1 个人防护•实验室服装和装备的选择和使用•实验操作中的安全措施和技巧•意外伤害的处理和紧急情况的应对2.2.2 生物安全•实验室生物安全的概念和原则•生物安全风险的评估和管理•生物安全实验室的设计和操作2.2.3 化学安全•化学品的分类和标识•化学品的储存和使用•化学品泄漏的处理和紧急情况的应对3. 课程安排本课程为期两天，每天分为理论和实践两部分•课程介绍和理论讲解（2小时）•基因提取和纯化的实验原理和方法（1小时）•基因提取和纯化的实验操作（4小时）•基因扩增的原理和操作步骤（1小时）•PCR实验操作（4小时）•基因分析的方法和技巧（1小时）•实验室安全的实践操作和演练（4小时）4. 课程目标通过本课程的学习，研究人员将能够：•理解和掌握基因实验的基本操作步骤和方法•识别和解决实验过程中的问题•遵守实验室安全的原则和实践•设计和执行安全的基因实验5. 课程费用本课程的费用为人民币2000元/人费用包括课程资料、实验材料和午餐住宿和交通费用自理6. 报名方式请将报名表格发送至以下邮箱：eml:******************请在邮件标题中注明“基因实验操作与安全知识的培训课程报名”7. 课程日期和地点课程日期：2023年4月10日至11日课程地点：XX大学生命科学学院实验室我们期待您的参与，共同学习基因实验操作与安全知识，提升实验室研究的质量和安全性1. 课程概述基因实验操作与安全知识的培训课程主要目的是为研究人员提供全面的基因实验技能和实验室安全管理知识本课程将深入介绍基因实验的各个环节，包括基因的提取、纯化、扩增和分析，同时强调实验室安全的重要性，涵盖个人防护、生物安全和化学安全等方面2. 课程内容2.1 基因实验技术2.1.1 基因提取与纯化•实验原理与方法•实验步骤与操作技巧•实验结果分析与解读2.1.2 基因扩增技术•PCR基本原理与操作步骤•扩增产物的分析与验证•常见问题与解决方案2.1.3 基因分析技术•电泳分离与鉴定基因•序列比对与分析•基因表达与功能验证2.2 实验室安全管理2.2.1 个人防护•实验室服装与装备的选择与使用•实验操作中的安全措施与技巧•意外伤害的处理与紧急情况的应对2.2.2 生物安全管理•实验室生物安全概念与原则•生物安全风险评估与管理•生物安全实验室设计与操作2.2.3 化学安全管理•化学品分类与标识•化学品储存与使用•化学品泄漏处理与紧急情况应对3. 课程安排本课程共计两天，每天包含理论与实践两部分内容•课程背景与理论讲解（2小时）•基因提取与纯化的实验原理与方法（1小时）•基因提取与纯化的实验操作（4小时）•基因扩增技术的原理与操作步骤（1小时）•PCR实验操作（4小时）•基因分析技术的方法与技巧（1小时）•实验室安全管理的实践操作与演练（4小时）4. 课程目标通过本课程的学习，研究人员将能够：•掌握基因实验的基本操作步骤与方法•解决实验过程中可能遇到的问题•遵循实验室安全原则与实践•设计并执行安全的基因实验5. 课程费用本课程费用为人民币2500元/人费用包括课程资料、实验材料、午餐及茶歇住宿与交通费用需自理6. 报名方式请将报名表格发送至以下邮箱：eml:******************请在邮件标题中注明“基因实验操作与安全知识的培训课程报名”7. 课程日期与地点课程日期：2023年5月15日至16日课程地点：YY大学生物科学与技术学院实验室我们期待您的参与，共同学习基因实验操作与安全知识，提高实验室研究的质量和安全性应用场合1.科研机构：适用于生物学、遗传学、医学等领域的研究人员，提高他们在基因实验操作中的专业技能和安全意识2.高等教育机构：针对生命科学、生物技术、医学等相关专业的本科生、研究生和教师，强化实验教学质量和安全规范3.制药企业：针对药物研发、生物技术等部门的员工，提升他们在基因实验操作中的技术水平和安全意识，以保证研发过程的安全性和有效性4.医疗机构：适用于从事基因检测、精准医疗等工作的医疗人员，加强他们在实际操作中的安全防护能力5.政府部门：针对从事生物安全和实验室管理的工作人员，提高他们在实验室安全监管方面的专业知识和实践能力注意事项1.严格遵循实验室安全规范：在实验操作过程中，必须遵守实验室安全规范，穿戴适当的个人防护装备，如实验室服装、手套、护目镜等2.充分准备和培训：参与培训的人员应在课程开始前熟悉基本的实验原理和操作流程，确保能够安全、准确地进行实验3.操作过程中的注意事项：–在进行基因提取、扩增和分析等实验操作时，应严格按照实验步骤和操作规程进行，避免人为错误–在处理危险化学品时，应遵循化学安全操作规程，防止化学品的泄漏和污染–在使用实验室设备时，应先了解设备的使用方法和操作规程，确保设备安全运行4.紧急情况应对：研究人员应熟悉紧急情况的应对措施，如发生化学品泄漏、生物安全风险等，能够迅速采取措施，降低风险5.生物安全和伦理考虑：在处理基因样本时，应遵守生物安全规定，防止病原体的传播和实验室感染同时，还要注意保护个人隐私和伦理问题6.持续学习和更新知识：基因实验操作和安全知识是不断发展的，研究人员应定期参加相关培训和研讨会，更新自己的知识和技能7.实验室环境管理：保持实验室的清洁和有序，合理布局实验区域，确保实验环境的安全生产条件8.记录和反馈：在实验过程中，应详细记录实验操作和结果，对于实验中出现的问题和异常情况，应及时反馈给导师或实验室负责人，共同分析和解决9.合规性和资质认证：参与培训的人员应具备相应的资质和合规性要求，如必要时需取得实验室安全操作证书10.实践与理论相结合：培训课程应注重实践操作与理论知识的相结合，通过实际操作演练，提高研究人员的安全操作技能和应急处理能力通过以上注意事项的遵循和应用场合的准确运用，可以确保基因实验操作与安全知识的培训课程能够有效地提升研究人员的安全意识和实验技能，从而保障实验室研究的质量和安全性。
《基因工程》实验教学教案一、实验背景基因工程是一门应用生物学的分支，通过对基因的操作和重组，实现对生物性状的改良和功能的研究。
本实验教学旨在让学生了解基因工程的基本原理，掌握基因克隆、表达和检测的方法，培养学生动手实践能力和创新思维。
二、实验目标1. 了解基因工程的基本原理及实验步骤；2. 掌握PCR扩增、DNA提取、酶切、连接、转化等实验技术；3. 学会分析实验结果，提高学生解决实际问题的能力；4. 培养学生团队合作精神和创新思维。
三、实验内容1. 基因克隆：利用PCR扩增目的基因，并进行酶切、连接，将目的基因插入到载体中；2. 基因转化：将重组载体导入受体细胞，筛选转化成功的细胞；3. 基因表达：对转化成功的细胞进行诱导表达，检测目的蛋白的表达情况；4. 实验结果分析：分析实验数据，探讨实验过程中可能存在的问题，并提出改进措施；四、实验材料与仪器1. 材料：大肠杆菌、质粒、PCR试剂、酶切酶、连接酶等；2. 仪器：PCR仪器、电泳仪、离心机、恒温培养箱、显微镜等。
五、实验步骤1. 实验前的准备工作：了解实验原理，阅读相关文献，准备实验材料和仪器；2. 基因克隆：设计引物，进行PCR扩增，酶切目的基因和载体，连接目的基因与载体，转化大肠杆菌；3. 基因转化：将重组载体导入受体细胞，筛选转化成功的细胞；4. 基因表达：对转化成功的细胞进行诱导表达，检测目的蛋白的表达情况；5. 实验结果分析：分析实验数据，探讨实验过程中可能存在的问题，并提出改进措施；注意事项：1. 严格遵循实验步骤和操作规范，确保实验安全；2. 实验过程中遇到问题，及时与教师沟通，寻求帮助；3. 注重团队合作，共同完成实验任务。
六、实验教学安排1. 理论讲解：2课时2. 实验操作：4课时3. 实验结果分析与讨论：2课时七、实验评价1. 实验操作的正确性和熟练程度；2. 实验结果的准确性及分析的深度；4. 团队合作与沟通能力的展现。
生物教案：遗传与基因的操作与实验一、引言遗传与基因的操作与实验是生物教学中的重要内容，通过学习与实践这一领域的知识，学生可以深入了解遗传学的基本原理与实验方法，探索生物的遗传规律与基因的作用机制。
本教案将以遗传与基因的操作与实验为主题，以培养学生的实验能力和科学思维为目标，设计一系列有趣且实用的教学活动。
二、理论部分：基因与遗传的基本概念1. 基因的概念基因是控制个体性状遗传的基本单位，是由DNA分子构成的一段特定的遗传信息。
每个基因都拥有特定的序列，决定了相应蛋白质的合成。
2. 遗传的基本原理遗传是指父代向子代传递性状的过程。
遗传的基本原理包括：（1）遗传物质的存在与传递：基因是遗传物质的基本单位，通过染色体的分离与组合，遗传物质得以传递至下一代。
（2）遗传物质的变异：基因会发生突变，产生新的变异基因，进而导致个体性状的变化。
（3）显性-隐性遗传规律：有些基因表现为显性，只需一个显性基因即可表现出相应性状；而有些基因表现为隐性，需两个隐性基因才能表现出相应性状。
三、实践部分：遗传与基因的操作与实验设计1. 实验一：观察遗传物质的提取与可视化目的：了解DNA是遗传物质的重要组成部分，并能够提取与可视化DNA。
步骤：（1）从新鲜水果中提取DNA：将不同水果（如苹果、香蕉、草莓）样品切碎，加入盐水，用细螺旋挤碎果肉，滤去果渣，得到DNA提取液。
（2）可视化DNA：将DNA提取液分装到试管中，加入酒精，静置片刻后，观察DNA的白色絮状物。
2. 实验二：观察基因的显性与隐性表型目的：通过观察实验材料（如豌豆）的显性与隐性表型，理解基因的遗传规律。
步骤：（1）选取豌豆品种，观察外部性状：如果形、果皮颜色等。
（2）进行杂交实验：选择两个具有不同外部性状的豌豆品种，进行人工授粉，观察后代的表型。
3. 实验三：使用PCR技术分析基因型目的：学习PCR技术的应用，分析个体的基因型。
步骤：（1）收集学生的DNA样本：通过口腔拭子采集学生的口腔黏膜细胞，提取DNA。
硕士研究生基因操作实验技术实验讲义实验简介：本实验的目的是将嗜热脂肪芽孢杆菌AS 1411的淀粉酶结构基因（全长1.4kb）采用PCR方法扩增后接入大肠杆菌表达载体pLac18，构建成重组载体pLac18-amy，重组载体再转化大肠杆菌JM109，重组大肠杆菌可以在IPTG的诱导下表达出耐热α-淀粉酶活性。
通过本实验的训练使学生在DNA重组，基因高表达方面得到全面的训练并加深对lac操纵子的理解。
实验一质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定1.1 实验材料LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LLB培养基II ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L，Glucose 5 g/L质粒小量快速提取试剂盒（由北京博大泰克公司赞助）含质粒pLac18的大肠杆菌JM109台式高速离心机‘水浴锅1.2 用硅胶膜分离法小量提取质粒这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。
用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开。
硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。
质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。
所有试剂均由试剂盒配套①接种重组大肠杆菌一环于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
②取1.5 ml离心管，倒入约1.5 ml菌液。
8,000 r/m离心30 s。
弃尽上清。
③加入100 L溶液1，彻底悬浮菌体。
④加入150 L溶液2，颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。
⑤加入150 l溶液3，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生，室温放置10 min，8,000 r/m离心3 min。
⑥在离心吸附柱中加入结合缓冲液（质粒提取专用）400 l，再将上清液加入离心吸附柱中，混匀，8,000 r/m离心30 s。
⑦倒弃收集管内液体，在吸附柱内加入500 l漂洗液，8,000 r/m离心30 s，洗去杂质。
⑧倒弃收集管内液体，8,000 r/m离心30 s，除去残留液体。
⑨将质粒纯化柱放在一干净的1.5 mL离心管中，加入75 l 洗脱缓冲液（elution buffer）至管内柱面上，放置10 min。
⑩8,000 r/m离心30 s，所得液体就是立即可用的超纯质粒。
1.3 质粒的酶切与电泳鉴定质粒的酶切实验材料质粒pLac18，上述实验提取限制性内切酶EcoR I、Hind III：宝生物工程（大连）有限公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助，包括酶20 U/L，酶反应缓冲液等实验步骤1．取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5 L，缓冲液M 2 L，限制性内切酶1 L，混匀。
2．将上述溶液于37 ℃水浴30 min。
酶切产物的电泳实验材料和仪器50×TAE缓冲液：Tris 242 g，冰醋酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 LTAE缓冲液：取50×TAE缓冲液10mL，加入纯水至500 mL溴化乙锭溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解琼脂糖：华美公司分装Amresco产品电泳槽：迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽）电泳仪：DYY-6B 稳压稳流电泳仪凝胶成像仪：美国alpha22001．取50 mL小烧杯一个，加入琼脂糖0.14 g，加入TAE缓冲液20 mL，在电炉上煮沸。
2．放置到约50 ℃时，加入溴化乙锭溶液1 L，混匀，倒入制胶槽中，插上制胶梳子。
3．待凝胶凝固后，将凝胶放入电泳槽内，拔取制胶梳子。
4．取待检测DNA 4 L，加入0.5 L加样缓冲液，混匀。
5．将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。
6．打开电泳仪，调节电压至50 V，保持稳压。
7．电泳约50min～，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。
实验二嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增以及PCR产物的纯化2.1 实验材料：Taq DNA聚合酶（含Taq酶Buffer，dNTP）（注：本实验中PCR反应试剂用上海赛百盛公司TaqPremix代替，该产品已经预先加入了水，Taq DNA聚合酶，酶反应缓冲液和dNTP，做PCR反应时只要加入特异性的模板DNA和引物即可），内切酶BamH I均为大连TaKaRa公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。
小量PCR产物纯化试剂盒为上海生工生物技术公司产品。
2.2 实验步骤A 淀粉酶基因的PCR扩增与鉴定1．取200 µL PCR管一支按顺序加入：TaqPremix 反应液 47µL引物: 2 µL嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA 1 µL94℃变性10 min,加入Taq DNA聚合酶5个单位。
2．混合后进行PCR反应(94℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 120 s)，经过20个循环后在72℃延伸10 min。
电泳鉴定PCR结果B 用硅胶柱纯化PCR产物1. 取PCR产物（50 L），转移到一干净的1.5 mL离心管中，加入5倍体积的Binding Buffer（PB），混匀。
2. 将硅胶柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，室温放置2分钟；8,000 r/m 离心30 s。
3. 倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，加入500 L 漂洗液（Wash Solution），8,000 r/m离心30 s。
4. 重复步骤4。
5. 倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，8,000 r/m离心30 s。
6. 将硅胶柱放入一干净的1.5 mL离心管中，在硅胶柱的膜中央加入50 L TE Buffer，室温10 min。
7. 8,000 r/m离心30 s，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
C. PCR产物的酶切鉴定1.取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5 L，缓冲液K 2 L，限制性内切酶BamH I 1 L，混匀。
2.将上述溶液于37 ℃水浴60 min，50V电泳60 min电泳鉴定酶切结果。
实验三感受态大肠杆菌JM109制备3.1 实验材料0.1mol/L CaCl2，纯水配制，过虑灭菌3.2 实验步骤1．挑取E.coli JM109单菌落于2ml液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2．取0.2ml培养液于20mlLB培养基中，剧烈振荡培养约1小时。
3．取1.5ml离心管，加入培养液1.5ml，冰浴15分钟，4℃，8,000R/M离心1分钟，弃尽上清液。
用预冷的0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体，于冰水中放置15分钟。
4．8,000 R/M离心1分钟，弃尽上清液，用预冷的100µl 0.1mol/L氯化钙悬浮菌体。
5．冰水中或4℃放置12-24小时，用于转化。
实验四 PCR产物和载体的酶切，纯化和连接4.1 实验材料：核酸内切酶EcoR I、Hind III，试剂盒高效连接液（mighty），均为TaKaRa公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。
小量DNA胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。
连接试剂盒为TaKaRa公司产品。
4.2 实验步骤A．PCR产物酶切取0.5mL离心管一支按顺序加入超纯水7µL经PCR纯化柱纯化的PCR产物：10µL缓冲液M：2.0µL核酸内切酶EcoR I、Hind III（混合物）1L混匀，8,000 r/m离心30 s37℃酶切3 hＢ．载体酶切取0.5mL离心管一支按顺序加入超纯水14µL载体：3µLBuffer M：2µL核酸内切酶EcoR I、Hind III（混合物）：1 µL混匀，8,000 r/m离心30 s37℃酶切3 hC．用硅胶柱纯化酶切载体及PCR产物同实验2D．PCR产物与载体的连接取经酶切纯化的PCR产物4µL，载体1 L混合加入连接试剂盒高效连接液 5µL，混合。
16℃反应过夜实验五连接产物的转化与转化子鉴定5.1 实验材料：感受态大肠杆菌5.2 实验步骤1．取感受态细胞1支（大肠杆菌JM109），加入连接产物1µL。
2．于冰水中放置20-30分钟， 42℃水浴准确计时90秒，冰浴5分钟。
3．各管加入LB培养基II 0.5ml，37℃水浴45-60分钟，涂布氨苄青霉素平板（固体LB培养基II中加入氨苄青霉素至100µg/ml），37℃培养16小时。
实验六连接转化子的鉴定6.1 实验材料6.2 转化子的鉴定1．挑取连接物转化子2个，在固体LB培养基II上划线分离，37℃培养过夜，各区一个菌落，分别接入10mL 液体 LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，37℃振荡培养过夜。
2．取菌液于1.5 ml离心管，8,000 r/m，1分钟离心收集菌体。
3. 提取质粒（同实验1）4．取10 L 质粒加入2L buffer M，1L EcoR I、Hind III酶混合液，混匀37℃反应30 min。
12．酶切产物电泳，凡能产生一条两个片段，分别为2.4kb和1.4kb为所需重组质粒（pLac18-amy），划线分离并保藏转化子。
实验七重组大肠杆菌转化子酶活鉴定7．1 实验材料：2％淀粉溶液碘液：2g KI ，1g I2，加水致100mL100 mg/mL IPTG为Pharmacia公司产品7．2 实验步骤1．挑取E.coli JM109（pLac18-amy）单菌落于10 ml液体LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，37℃振荡培养过夜。
2. 取100 mL菌液于10 ml液体LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，培养至对数后期，离心收集细胞。
分别以2 mL下列液体培养基悬浮细胞：A：液体LB培养基B：液体LB培养基II振荡培养4h。
2．培养液用超声波破碎（一秒隔一秒，30分钟）。
3．细胞破碎液分别与1%的淀粉溶液混合，于65℃保温1h，加入碘液检测淀粉酶活力。
附：实验原理及详细实验步骤请参考《现代发酵微生物实验技术手册》（诸葛健等，化工出版社，2005）第六章pLac182482bpbla(CDS)ColE1Plac lacZ'Aat II(69)ApaL I*(316)ApaL I*(1562)ApaL I* (2301)Ssp I(183)Dra I*(1774)Dra I* (2387)Ahd I(988)Pvu II(2056)Nde I (2296)EcoR I(2209)Hind III(2218)实验报告要简明，与讲义相同的步骤和方法不要写，直接写“参考实验讲义”，实验报告每组一份由班长林清收齐后交老师，最迟为下学期开学后第二周。
