基因工程实验流程 PDF版

基因工程实验报告学号姓名1实验目的（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。

（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。

（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。

（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。

（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。

（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。

（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。

2 实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。

当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。

碱裂法获得的质粒DNA 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。

2.2 PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。

在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。

在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。

反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA 序列以指数形式扩增。

循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。

《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。

在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。

转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。

同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。

三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。

含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。

基因工程实验注意事项1．上实验课不能迟到。

上实验课不能迟到。

2．一定要提前预习实验内容，弄懂实验原理，理清实验顺序。

根据实验内容和步骤制定一个详细的试验计划（没有计划或计划不合理者不能进入实验操作）。

3．实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。

各小组学生需要根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。

作技术。

各小组学生需要根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。

4．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。

由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。

5．本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等严格的作息安排，一切服从实验进度，但必须在10天之内完成。

天之内完成。

6．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！7．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。

在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

8．写作实验报告一定要文字整洁，观察记录详细（包括操作的错误），分析现象透彻。

，分析现象透彻。

9．在实验室内不能大声喧哗。

在实验室内不能大声喧哗。

10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！随地投弃！11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。

开实验实。

12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。

．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。

13．实验时损坏的任何物品都要按规定赔偿。

．实验时损坏的任何物品都要按规定赔偿。

实验流程参考图PCR 扩增NK 制备感受态菌DH5a, BL21 提质粒pMD18-T-NK ，pET-his ，EcoRI+BamHI 酶切酶切与pUCm-T 连接连接转化DH5a 筛选鉴定筛选鉴定提质粒pUCm-T-NK 回收pET-his EcoRI+BamHI 酶切酶切回收NK 片断片断 pET-his-NK 诱导表达诱导表达SDS-PAGE 鉴定鉴定转化DH5a 连接连接pET-his pMD18-T-NK DH5a BL21 筛选鉴定筛选鉴定提质粒pET-his-NK 转化BL21 第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验一质粒DNA的小量制备1．目的学会最常用的小量制备质粒的DNA的碱裂解方法。

实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。

2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。

3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。

4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。

6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。

7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。

8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。

2、将管放到42C保温90s,冰浴2。

3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。

4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。

二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。

2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。

3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。

4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。

（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。

6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。

7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。

8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。

9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。

实验一：大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备【实验步骤】1 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

2 取1mL培养物接种到100mL LB培养基（250mL三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。

3 将菌液转移到50mL离心管（2管）中，冰上放置15min。

4 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5 用20 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液。

6 用10 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。

7 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液悬浮。

8 分装到数个EP管中，每管200 uL，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（T-SOD或T-IL218）和表达载体质粒（PET32或PET30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混匀，冰上放置30min。

2、将EP管放到42℃保温90s，冰浴 2min。

3、加入800uL LB液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。

4、将100 uL 的复苏细胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培养皿中，正置平皿30min （使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。

二、质粒的提取1 挑取单菌落接种于100 mL 加入50uL Amp 的LB液体培养基中，振荡培养过夜。

2 过夜培养的菌液加入1.5 mL的小指管（20个每组）中，每次1 mL，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。

3 加入150uL溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。

4 加入350uL溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。

基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。

121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。

B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。

C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。

Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。

D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。

E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。

100 o C加热15分钟，冷却后分装。

H.饱和酚：市售酚需重蒸。

重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。

I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。

J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。

K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。

三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。

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基因工程实验技术实验报告百度ID：龍吟EX炫1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验对象实验室提供的小鼠；含pGEX 4T-1质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)，大肠杆菌Top10。

1.1.2 试剂LB液体培养基，LB固体培养基，0.1% DEPC水，无水乙醇，氯仿，异丙醇，Trizol，Olig(dT)18，反转录缓冲液，dNTP，M-MULV反转录酶，RNA抑制剂，2×PCR Mix，Olig(dT)18引物，表达引物EB3、EB4，5×TBE缓冲液，10×Loading buffer，核酸染料Super Gel Red，琼脂糖，Bam H I，Sal I，Bam H I buffer，10×ligation缓冲液，T4 DNA连接酶，ddH2O，氨苄青霉素，IPTG，30%丙烯酰胺，1.5mol/L和0.5mol/L Tris-HCl，10% SDS，10%过硫酸铵溶液，染色液，脱色液，TEMED，Tween-20，DAB工作液、显色液，TIANGEN胶回收试剂盒，TIANGEN质粒提取试剂盒。

1.1.3 仪器高速冷冻离心机，核酸电泳设备，PCR扩增仪，恒温水浴锅，凝胶成像系统，蓝光切胶仪，无菌操作台，恒温摇床，蛋白电泳设备，电转移设备，移液枪1.2 方法1.2.1 实验材料的处理对小鼠进行处死，解剖并取出肝脏组织，备用。

1.2.2 Trizol法提取总RNA将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，取50～100mg加入已盛有1ml Trizol离心管中，轻轻混合以排除气体，再充分混匀；室温放置5min，然后加入200μl氯仿，盖紧离心管，并剧烈摇荡15秒钟；12,000rpm离心10min，取上层水相到新的离心管中，加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。

室温放置10min后12,000rpm离心10min；小心地弃去上清液，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，颠倒混匀，12,000rpm离心5min，再重复一次上述操作；弃去上清液，室温或真空干燥3～5min，后用30μl DEPC水溶解RNA。

（整理）基因⼯程试验.基因⼯程实验流程实验⼀丹参总DNA的提取实验⽬的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的⽅法。

实验材料：丹参叶⽚实验器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，研钵和杵，离⼼管，微量移液器，枪头实验步骤：第⼀次使⽤前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加⼊指定量的⽆⽔⼄醇，充分混匀，加⼊后请及时在⽅框打钩标记已加⼊⼄醇，以免多次加⼊!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使⽤前加⼊β-巯基⼄醇到终浓度2%。

1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或⼲重组织30 mg）在研钵中加⼊液氮充分碾磨成细粉。

2.转移细粉到⼀个1.5ml离⼼管，不要解冻，加600µl 65℃预热的裂解液PL (确认已加⼊β-巯基⼄醇⾄2%)，剧烈涡旋振荡混匀，⽤⼤⼝径枪头轻柔吹打帮助裂解。

如果组织裂解困难，可根据需要加⼀个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。

3.65℃⽔浴20-60分钟，在⽔浴过程中颠倒离⼼管以混合样品数次。

可选如果组织⼲燥或者产量低，可以适当延长⽔浴时间。

如RNA残留多，可在⽔浴前加⼊6µlRNA酶（20mg/ml）。

4.加⼊700µl氯仿/异戊醇（体积⽐24：1混合），颠倒充分混匀⼏分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离⼼5分钟。

若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前⽤等体积酚/氯仿（1：1）抽提⼀遍。

5.⼩⼼吸取上清到⼀个新的1.5ml离⼼管，注意不要吸到界⾯物质。

如上清⽐较浑浊，则需要重复步骤4⼀遍，直到得到透亮上清。

6.较精确估算上清量，加⼊1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加⼊⽆⽔⼄醇!）后⽴刻涡旋，充分混匀。

此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。

7.将上⼀步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加⼊⼀个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - ⼊收集管中）13,000rpm离⼼30秒，倒掉收集管中的废液（先加700µl离⼼，弃废液，再加⼊剩余的溶液，再次离⼼）。