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第26卷第4期2005年8月西安交通大学学报(医学版)J o u r n a l o fX i'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l.26N o.4A u g.2005G F P重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在N I H3T3细胞中的表达邢俊平1,2,杨宇3,王全颖4,杨广笑4,邱曙东2(1.西安交通大学第一医院泌尿外科;2.西安交通大学生殖医学研究中心,陕西西安710061;3.吉林大学第一医院神经内科,吉林长春130021;4.西安华广生物工程公司分子生物学实验室,陕西西安710025)摘要:目的构建以绿色荧光蛋白(G F P)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。
方法采用D N A重组技术将G F P基因片段亚克隆到p s s H G C MV载体的E c o RⅠ和B a m HⅠ位点,构建表达G F P重组腺相关病毒载体p s s H G C MV-G F P。
以此载体转染143细胞进行G F P重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。
用地高辛标记的C MV p o l y A片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。
采用氯化钙法体外转染培养的N I H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。
结果成功构建了G F P重组腺相关病毒载体和报告病毒-V s s C MV-G F P,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/m L。
重组腺相关病毒V s s C MV-G F P感染N I H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。
结论V s s C MV-G F P对真核细胞具有感染能力,并且G F P可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。
g f p基因的克隆与表达(共7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001 姓名：刘会淼2013年3月13实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入 DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
1.材料与方法：实验材料克隆菌 DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ仪器设备Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管试剂及溶液分装后于121 ℃高压灭菌20 min。
（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液Ⅰ 50 mL葡萄糖50 mmol/LTris-Cl (pH 25 mmol/LEDTA (pH 10 mmol/L121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ 100 mLNaOH mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液Ⅲ 100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 mLH2O mL121 ℃高压灭菌 15 min后置于0~4 ℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
重组质粒的构建[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。
因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
[仪器、材料与试剂]恒温摇床、紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T 4DNA连接酶缓冲液、载体、目的DNA片段[实验步骤]1、在微型离心管中混合以下试剂：试剂体积（uL）目的DNA 4载体分子1T4DNA连接酶及缓冲液52、混合液于16℃保温2-4h或过夜，取2uL做电泳检查，鉴定反应连接产物，做完DNA重组后，暂放冰箱保存，迅速做转化实验。
通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究杨宇;王全师;吴江;胡海涛;胡林森;杨广笑【期刊名称】《中风与神经疾病杂志》【年(卷),期】2004(21)1【摘要】目的构建基因治疗通用型AAV载体并检测它转导外源基因作用.方法使用限制性内切酶切出pSSV9int-质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV.在该质粒MCS插入GFP基因后,我们使用pSSHG-CMV-GFP、pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞,荧光显微镜观察GFP表达.结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011,浓缩后可达2×1013,表明成功的构建了重组AAV载体,插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV.感染了重组GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的GFP荧光.结论本文构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV,可转导外源基因,用于基因治疗的研究.【总页数】3页(P10-12)【作者】杨宇;王全师;吴江;胡海涛;胡林森;杨广笑【作者单位】吉林大学第一医院神经内科,吉林,长春,130021;西安交通大学解剖教研室,陕西,西安,710000;吉林大学第一医院神经内科,吉林,长春,130021;西安交通大学解剖教研室,陕西,西安,710000;吉林大学第一医院神经内科,吉林,长春,130021;西安交通大学解剖教研室,陕西,西安,710000【正文语种】中文【中图分类】Q344【相关文献】1.双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王顺娟;夏海滨2.构建以 eGFP 为报告基因的毕赤酵母表达载体 [J], 陈志文;冯姣;蒋敏敏;陈春梅;肖星;何娅;易修文;陈庭金;席丽艳3.通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究 [J], 郑国玺;韦俊荣;祝康;侯瑾;施典羽;朱宏亮;杨广笑;王全颖4.含报告基因GFP的hGH真核表达载体的构建 [J], 宋晓妍;袁云;闫志勇;张娓;张钦宪5.构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定 [J], 杨天燕;王乃平;王劲;刘冠达;韦锦斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母菌表面展示操作步骤之病毒载体构建酵母菌表面展示技术是一种利用酵母细胞表面附着或展示外源蛋白的技术，广泛应用于蛋白质互作、高效酶催化等领域。
而病毒载体则是一种常用的酵母表面展示工具，利用病毒颗粒的稳定性和灵活性，可以有效地展示外源蛋白。
下面将详细介绍病毒载体构建的操作步骤，以供参考：1. PCR扩增目标基因：首先，从所需的基因资源中提取目标基因的DNA序列。
设计引物并进行PCR 反应，扩增目标基因片段。
确保引物的特异性和合理的扩增条件。
2. 构建目标基因的表达载体：将PCR扩增得到的目标基因片段与适当的表达载体进行连接。
表达载体可以根据实验需要选择，常用的有pET等质粒载体。
连接可以通过酶切、连接酶等方法进行。
3. 转化酵母细胞：将得到的重组表达载体转化到酵母细胞中。
常用的酵母细胞有酵母菌Saccharomyces cerevisiae。
转化方法可以选择化学法、电转法或直接注射法，具体方法根据实验室条件和实验目的进行选择。
4. 筛选阳性克隆：通过选择性培养基，筛选含有重组表达载体的酵母细胞。
选择性培养基中含有特定抗生素或表达特定标记物的基因，可以选择性地培养阳性克隆。
5. 验证表达：从阳性克隆中提取酵母总蛋白，通过蛋白鉴定方法如SDS-PAGE或Western blot等进行目标蛋白的验证。
确认目标蛋白的表达情况。
6. 病毒包装：将经验证的酵母表达载体转染到病毒包装细胞中，通过细胞内的重组表达载体转录和病毒包装蛋白的辅助，使病毒组装出现。
包装可以采用辅助病毒或者可移动元件。
7. 提纯病毒颗粒：将包装完成的病毒颗粒从细胞中提取出来。
可以通过超低速离心、密度梯度离心或离子交换层析等方法进行纯化。
提纯后的病毒颗粒即可用于酵母表面展示。
8. 酵母菌表面展示：将提纯的病毒颗粒与酵母细胞进行共培养。
病毒颗粒通过与酵母细胞表面特异性的结合蛋白相互作用，将目标蛋白表面附着在酵母菌表面上。
共培养时间可以根据实验需要进行调整。
A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建构建基于腺病毒的多基因重组载体是一种常见的遗传工程方法，可以将多个外源基因同时导入宿主细胞中，从而达到多基因的表达。
在A型FMD的研究中，也有人尝试使用腺病毒作为载体来构建疫苗，以提高其蛋白质表达水平。
构建多基因重组腺病毒载体的第一步是选择合适的腺病毒，通常选择腺病毒2型或5型。
然后，将需要表达的外源基因插入到腺病毒基因组中的特定位点。
在这个过程中，需要使用限制性内切酶来切割腺病毒基因组和外源基因的质粒，然后使用DNA连接酶将它们连接在一起。
连接完成后，将构建好的腺病毒基因组导入到宿主细胞中，通过细胞内的复制和转录机制，使外源基因得以表达。
在构建多基因重组腺病毒载体的过程中，还需要一系列的筛选步骤以确保正确的腺病毒基因组被表达。
通常采用PCR技术来筛选转染细胞中是否存在目标基因，并使用DNA测序来验证基因的正确插入。
此外，还需要通过对表达目标基因的细胞进行酶切分析和质谱鉴定等方法来鉴定腺病毒基因组的稳定性和表达水平。
构建多基因重组腺病毒载体的成功，可以大大提高对A型FMD的防控效果。
通过同时表达多个与免疫反应相关的基因，可以增强宿主动物对FMD病毒的免疫力，从而减少感染和传播。
同时，可以通过优化腺病毒载体的表达能力，使其能够持续地表达目标基因，从而增强疫苗的效果。
总之，构建多基因重组腺病毒载体是一种有潜力的方法来提高对A型FMD的防控效果。
该方法可以通过同时表达多个免疫相关基因来增强宿主动物的免疫力，从而减少感染和传播。
在未来的研究中，我们将进一步优化这种方法，以提高其在FMD防控中的应用价值综上所述，构建多基因重组腺病毒载体是一种有潜力的方法来提高对A型FMD的防控效果。
通过使用性内切酶和DNA连接酶，成功将外源基因与腺病毒基因组连接在一起，并导入宿主细胞中进行表达。
筛选步骤包括PCR技术、DNA测序、酶切分析和质谱鉴定等，以确保腺病毒基因组的稳定性和正确插入目标基因。
VEGF_(121)重组腺相关病毒载体的构建与鉴定
基因治疗是目前治疗多种疾病的一种新兴领域，而腺相关病毒（Adenovirus，Ad）是作为基因治疗载体的热门选择之一。
其中，VEGF_（121）是一种血管内皮生长因子，已证明在血管
生成和血管再生上具有重要作用。
因此，VEGF_（121）重组
腺相关病毒载体的构建与鉴定具有重要意义。
首先，基于Ad常见的载体pAdEasy-1，使用PCR扩增的方法
获得VEGF_（121）基因的DNA序列，并构建出VEGF_（121）的表达质粒。
然后，将VEGF_（121）的DNA序列克隆到pAdEasy-1载体上，利用从BHG-10细胞中提取到的腺病
毒全长基因组，采用电穿孔法将表达质粒转染到细胞中，经过筛选和扩增，得到表达VEGF_（121）的重组腺相关病毒载体。
接下来，为了验证得到的重组病毒是否达到预期效果，需要进行病毒鉴定工作。
首先，通过PCR和测序等手段鉴定重组载
体里VEGF_（121）的插入位点是否正确，并进一步检查重组
病毒的序列信息是否与预期一致。
然后，将获得的重组病毒接种于细胞培养基中，观察细胞内是否有VEGF_（121）的表达，以及血管生成和血管再生是否有一定的增加。
最后，通过动物试验验证重组病毒是否具有较好的生物学活性和安全性。
总之，VEGF_（121）重组腺相关病毒载体的构建与鉴定是一
个复杂的过程，需要综合运用分子生物学、细胞生物学和动物学等相关知识和技术，才能保证重组病毒达到预期效果，并在基因治疗中发挥重要作用。
α淀粉酶重组菌的构建及表达
α淀粉酶重组菌的构建及表达通常需要经过以下步骤：
1. 构建重组质粒：将α淀粉酶基因插入质粒中，并通过酶切验证基因序列的正确性。
常用的质粒载体包括pET、pGEX等，这些载体具有表达载体、选择标记和多克隆位点等功能。
2. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化到宿主菌中，常用的宿主菌包括大肠杆菌、枯草杆菌等。
3. 筛选重组菌：在选择性培养基中培养宿主菌，筛选出含有重组质粒的菌株。
常用的选择性培养基包括IPTG、X-gal 等。
4. 表达重组蛋白：将重组菌在适当的温度、pH和营养条件下培养，使其表达重组蛋白。
常用的表达系统包括诱导表达、强制表达等。
5. 纯化重组蛋白：通过各种纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等，从宿主菌中纯化出重组蛋白。
6. 检测重组蛋白：通过各种检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等，检测重组蛋白的表达和纯度。
总之，α淀粉酶重组菌的构建及表达需要经过多个步骤，需要掌握相关的分子生物学和微生物学知识，并使用各种实验技术进行操作。
富含cpg基序的重组质粒的构建及制备
富含CpG基序的重组质粒的构建及制备是一种常用的基因工
程技术，用于研究DNA甲基化和免疫调节等领域。
下面是一
种常见的构建和制备步骤：
1. 选择一个含有目标基因的载体：在构建富含CpG基序的重
组质粒之前，需要选择一个适合的载体来携带目标基因。
常用的载体有质粒、病毒、贝壳和非病毒等。
2. 设计并合成CpG基序：根据研究需要，设计一条或多条富
含CpG基序的DNA序列。
CpG基序是一种由甲基化的腺嘌
呤（C）和鸟嘌呤（G）组成的二聚体序列，与免疫反应相关。
3. 将CpG基序插入载体：利用限制性内切酶将目标载体线性化，然后将合成的CpG基序片段连接到载体的合适位点上。
连接可以通过DNA连接酶或PCR扩增等方法实现。
4. 验证重组质粒：转化含有CpG基序的重组质粒到适当的宿
主细胞（如大肠杆菌），并通过筛选和测序等方法验证重组质粒的正确性和完整性。
5. 制备重组质粒：利用大规模培养菌体的方法制备含有重组质粒的DNA。
这涉及到大量培养、菌体破碎和纯化等步骤。
6. 浓缩与纯化：通过离心等方法将大量培养产生的细菌溶液浓缩，然后进行DNA纯化，以去除杂质。
7. 鉴定重组质粒：通过凝胶电泳和酶切等方法，检测和验证重组质粒的纯度和完整性。
8. 储存和保存：将纯化的重组质粒以适当的冻存条件保存，并记录相关信息以备将来使用。
通过以上步骤，可以成功构建和制备富含CpG基序的重组质粒，为后续的实验和研究提供基础。
绿⾊荧光蛋⽩（GFP）基因的克隆和表达（新⼿详细注释版）绿⾊荧光蛋⽩(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿⾊荧光蛋⽩（green fluorescent protein，GFP）是⼀类存在于包括⽔母、⽔螅和珊瑚等腔肠动物体内的⽣物发光蛋⽩。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿⾊荧光。
它产⽣荧光⽆需底物或辅因⼦。
发⾊团是其蛋⽩质⼀级序列固有的。
GFP 由3个外显⼦组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋⽩,相对分⼦质量为27. 0kMr，其蛋⽩性质⼗分稳定，能耐受60℃处理。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋⽩质中央是⼀个圆柱形⽔桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中⼼α螺旋的反平⾏β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直⽚段覆盖，底部由⼀个短的垂直⽚段覆盖，对荧光活性很重要的⽣⾊团则位于⼤空腔内。
发⾊团是由其蛋⽩质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly⾃⾝环化和氧化形成.实验⼀质粒DNA的分离与纯化⼀、实验⽬的掌握⼀种最常⽤的质粒DNA提取⽅法：碱裂解法。
该法⽤于从⼩量培养物中抽提质粒DNA，⽐较⽅便、省时，提取的质粒DNA质量较⾼，可⽤于DNA的酶切、PCR甚⾄测序。
⼆、基本原理质粒是⼀类在细菌细胞内发现的独⽴于染⾊体外，能够⾃主复制的稳定的遗传单位。
迄今为⽌，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分⼦，分⼦量范围从1kb到200kb。
质粒DNA 可持续稳定地处于染⾊体外的游离状态，但在⼀定条件下⼜会可逆地整合到寄主染⾊体上，随着染⾊体的复制⽽复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在⼤多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染⾊体复制时所⽤的酶是相同的。
有些质粒复制受宿主细胞复制作⽤的严格限制，因此每个细胞中只含⼀个或⼏个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数⽬可达10-200个拷贝。
ｕＰＡ基因重组ＧＦＰ－腺相关病毒载体质粒的构建及其表达摘要：利用基因重组技术，用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得μPA cDNA，再克隆到质粒pAAv-IRES-hrGFP的多克隆位点，构建重组质粒pAA V-hrGFP-uPA，通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性，采用磷酸钙共沉淀法，以重组质粒pAAv-hrCFP-uPA和pAAv-RC、pHelper共转染AAv-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒；用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中，倒置荧光显微镜观察GFP的表达，用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达，结果表明：成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒，病毒滴度达每mL4×1013病毒颗粒，60％～70％肾小管细胞感染了病毒颗粒，感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白，为今后建立AA V－uPA 基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础。
关键词：uPA；GFP；腺相关病毒载体；基因转染尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA还可通过激活纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA 激活肝细胞生长因子间接对损伤肾脏起保护作用，因此uPA在降解ECM、逆转纤维化方面起重要作用，肾脏纤维化的病理改变主要是肾小球硬化和，肾小管间质纤维化，是肾脏ECM合成与降解失衡，导致ECM过度积聚的结果，因此，我们设想采用高效表达载体-腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AA V)载体，将uPA基因全长序列转移到有纤维化病变的部位，以增强病变局部uPA的表达，发挥其降解ECM的作用，从而缓解肾纤维化的进程，为临床治疗肾脏纤维化提供理论基础。
1材料和方法1．1材料AA V Helper-Free System(#240071)、pAA V-IRES-hrGFP(#240075)、AA V-293细胞(#240073)和XL10-Gold感受态细菌(#200314)购自美国Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)购自美国invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)购自美国Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)购自美国Fermen-tas MBI公司，限制性核酸内切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)购自美国NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)购自中国长沙安比奥公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技术有限公司合成，测序由上海生工生物技术有限公司完成，兔抗Flag M2抗体(F1804-200UG)购自美国Sigma公司，2周龄SD雄性大鼠购自中南大学湘雅二医院动物实验中心，肾小管上皮细胞由中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室保存。
1．2方法1．2．1大鼠肾脏uPA基因的获得取Spragoc-Dawleg 2周龄雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取肾脏总mRNA，逆转录合成eD-NA第一链，PCR法特异扩增uPA cDNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，uPA cDNA为1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切产物，置pH8.0 TE 缓冲液中，uPA cDNA-20℃保存。
1．2．2pGEM-T-uPA重组质粒的构建将uPA cDNA用T4 DNA ligase连接到pGEM-T Easy载体上，并转染到JM 109感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃恒温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mLLB培养液内(Amp)，于37℃摇床内培养14h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到pGEM-T-uPA 重组质粒，将重组质粒用BamHI/Xho I双酶切后，证实含相应的uPA基因片断，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片断，-20℃保存。
1．2．3pAA V-hrGFP-uPA重组质粒的构建将上一步骤中获得的uPA基因片段用T4DNA ligase连接到pAA V-IRES-hrGFP质粒的多克隆位点，并转染到XL 10-Gold感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mL LB培养液内(Amp)，于37℃摇床内振摇培养14～16h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到DAA V-hrGFP-uPA重组质粒，将重组质粒用BamH I/Xho I双酶切后，证实含uPA基因片断，DAA V-hrGFP-uPA 重组质粒送检测序，准备足够的pAA V-hrGFP-uPA重组质粒和其他两个辅助质粒oAA V-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超纯质粒，供下一步转染实验。
1．2．4AA V-293细胞培养AA V-293细胞来源于普通的HEK293细胞系，但是可以产生较高的病毒滴度，HEK293是转染了腺病毒5型DNA的人胚胎肾细胞，AA V-293细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长，AA V-293细胞贴壁不牢，轻吹大瓶壁即可传代，在细胞达到50％融合时传代，且传代不宜超过20代，同时注意传代和接种时不要让细胞成块。
1．2．5pAA V-hrGFP-uPA的产生及鉴定接种3×106个AA V-293细胞于100mm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养2d细胞达到70％～80％融合时，吸取每个质粒溶液pAA V-hrGFP-uPA质粒、pAA V-RC和pHelper(浓度均为1g/L)各10μg加入到15mL 柱状试管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，轻轻混匀，加入1mL 2×HBS于另一柱状试管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反复吹打混匀，以点滴方式加入DNA/CaCl2/HBS悬液于AA V-293细胞的培养皿中，旋转均匀分散该DNA 悬液，将培养皿放人37℃的培养箱中培养6h，培养结束后，添加10mL新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续在37℃培养箱中培养72h，培养结束后，收集培养基和细胞于15mL的柱状试管中，经过4次冰冻和解冻(37℃)循环，每次持续10min，然后于室温中离心(10000g)10min，转移上清(初病毒储存液)于另一新的试管中置-80℃保存，Buffer TE代替质粒作阴性对照，转染后48h倒置荧光显微镜观察GFP表达，以确定转染成功；转染后72h收集病毒颗粒，并将获得的病毒颗粒再次感染AA V-293细胞，以确定其感染能力。
1．2．6病毒载体的纯化与滴度测定对重组的pAA V-hrGFP-uPA用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析进行纯化：纯化后用斑点杂交方法检测重组病毒的滴度；利用高压液相层析(HPLC)法检测重组病毒的纯度，具体方法参照文献。
1．2．7uPA基因转染肾小管细胞及其表达的测定按每孔1.5×105个肾小管细胞接种于12孔培养平板中，培养细胞达到70％融合，每孔添加终浓度为4mol/L羟基脲和1mol/L丁酸纳，混匀后，放人培养箱中继续培养5～6h，吸出培养基，加入 1.5mL预温的含20％小牛血清的DMEM/F12培养基和相应的病毒存储液0.5mL，继续培养48h，培养结束后。
倒置荧光显微镜观察GFP表达，uPA基因的表达以Flag标记蛋白进行免疫组化染色来判断，一抗为兔抗Flag M2抗体(1:200)，二抗为生物素化的羊抗兔抗体，加SABC孵育后进行DAB显色。
2结果2．1uPA cDNA片段的获得用RT-PCR法扩增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，琼脂糖凝胶电泳证实所得到的基因片段是正确的(图1)。
2．2 pAA V-hrGFP-uPA重组质粒的酶切鉴定pAA V-hrGFP-uPA重组质粒经BamH I/Xho I双酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAA V-hrGFP-uPA重组质粒的构建正确(图2)。
2．3pAA V，hrGFP-uPA重组质粒DNA序列分析证实pAA V-hrGFP-uPA序列完全正确，无碱基突变。
2．4pAA V-hrGFP-uPA的产生分别取pAA V-hrGFP-uPA和pAA V-RC、pHelper质粒各10μg，经磷酸钙沉淀法共转染AA V-293细胞2～3d，Buffer TE代替质粒转染细胞作阴性对照，阴性对照平皿中AA V-293细胞长满后有少量细胞漂浮，但平皿上一直布满细胞，培养基变成桔黄色，提示阴性对照没有病毒颗粒产生，转染质粒的AA V-293细胞逐渐聚集成团并漂离平皿，培养基中有大量漂浮细胞，培养基的颜色由桔黄色变为黄色，细胞肿胀、变圆，将质粒转染组在倒置荧光显微镜下观察，可见细胞呈绿色，表明转染成功(图3、4)。
2．5uPA基因转染肾小管上皮细胞及其表达AA V-293细胞产生的病毒颗粒转染肾小管上皮细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察约60％～70％的肾小管上皮细胞表达绿色荧光蛋白，免疫组化法观察到肾小管上皮细胞可有效表达flag蛋白，细胞质中具有较多的棕黄色颗粒，阴性对照组均没有绿色荧光蛋白和flag蛋白的表达(图5、6)。
3 讨论肾小球硬化和肾间质纤维化归根结底是肾脏ECM合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果，目前已知参与ECM降解的酶主要有3类：1)丝氨酸蛋白酶；2)基质金属蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前两类，uPA属于丝氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形态发生、组织修复和肿瘤浸润，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA还能切断纤溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-缬氨酸序列中的精氨酸-缬氨酸连接，催化无活性的纤溶酶原转变为纤溶酶，uPA对纤溶酶原的激活是一个正反馈逐级放大效应，纤溶酶是一广谱蛋白酶，能够降解存在于基底膜和，ECM的各种糖蛋白包括血纤维蛋白、粘连蛋白、层连蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，进而溶解血管内的纤维蛋白凝块和ECM成分，并形成细胞外局部溶解区。
