腺病毒重组系统
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重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎效果分析小儿腺病毒肺炎是一种由腺病毒引起的急性呼吸道感染,常见于婴幼儿和儿童。
目前,治疗该疾病的主要手段是对症治疗,如支持性治疗和抗生素治疗等,但没有特效药物。
近年来,重组人干扰素α1b在治疗该疾病方面得到了越来越广泛的应用。
本文通过对该药物治疗小儿腺病毒肺炎的效果分析,旨在为临床治疗提供参考。
1. 重组人干扰素α1b的药理作用重组人干扰素α1b是一种免疫调节剂,能够增强机体的免疫功能,抑制病毒生长和繁殖,同时还有抗炎和抗氧化作用。
在小儿腺病毒肺炎的治疗中,其主要作用是通过增强机体的免疫功能,促进巨噬细胞的活化和病毒清除,从而缓解症状,提高治愈率和预后。
重组人干扰素α1b的临床应用主要是静脉注射,每日1次,剂量为0.01-0.02μg/kg,连续使用5-7天。
在小儿腺病毒肺炎的治疗中,通常在症状出现3-7天内开始使用,以最大程度地发挥其治疗效果。
重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎的效果已经得到了多项研究的证实。
一项针对小儿腺病毒肺炎患儿的多中心随机对照试验显示,重组人干扰素α1b治疗组的治愈率明显高于对照组(81.8% vs 23.5%)。
另外还有研究表明,该药物在治疗小儿腺病毒肺炎并发症,如哮喘、支气管炎和肺炎等方面,也具有显著的疗效。
重组人干扰素α1b的不良反应相对较少,但也不可忽视。
常见的不良反应包括轻微发热、头痛、乏力、肌肉酸痛和注射部位的疼痛、红肿等。
在使用该药物时,应密切观察患儿的反应和症状,必要时可适量减少药物的剂量或调整治疗方式。
综上所述,重组人干扰素α1b在治疗小儿腺病毒肺炎方面具有显著的疗效和安全性,可作为小儿腺病毒肺炎的一线治疗药物之一。
但由于其目前的临床研究还相对较少,需要更多的临床试验和实践经验来进一步验证其疗效和安全性。
重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎效果分析
重组人干扰素α1b是人体自身产生的一种抗病毒蛋白质,能够干扰病毒的复制过程,增强机体的免疫力,从而抑制病毒的活性。
研究表明,重组人干扰素α1b可以有效地抑制小儿腺病毒的复制,减少病毒的感染范围和病程,提高患儿的治愈率。
在临床实践中,重组人干扰素α1b常用于小儿腺病毒肺炎的治疗。
一般情况下,患儿在发病初期即可使用该药物,每日一次,每次剂量根据患儿的年龄和体重而定。
研究发现,使用重组人干扰素α1b能够减轻小儿腺病毒肺炎的临床症状,如咳嗽、喉咙痛、流涕等,并可缩短病程,使患儿早日康复。
重组人干扰素α1b还能够增强机体的免疫功能,提高患儿的抵抗力。
研究表明,使用重组人干扰素α1b能够增加患儿的白细胞计数和淋巴细胞计数,促进淋巴细胞的分化和增殖,增强机体的免疫功能。
这些结果表明,重组人干扰素α1b在治疗小儿腺病毒肺炎的还能够提高患儿的免疫力,降低二次感染的风险。
慢病毒,腺病毒,逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统;慢病毒感染宿主细胞时,可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中,实现目的基因稳定、长期的表达,非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
腺病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统;但与慢病毒不同的是,腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中,而是游离于宿主基因组外独立表达,因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达,同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应,安全性和可控性高。
逆转录病毒表达系统
逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中,可实现目的基因稳定、长期的表达逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性,不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主细胞。
辉骏生物采用的病毒包装细胞系为plat E 细胞系,该细胞系包含gag、pol和env基因,因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒,但是该病毒具有很强的针对性,只适用于大鼠、小鼠细胞稳定株的建立。
三种病毒表达系统的特点。
重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎效果分析
重组人干扰素α1b具有广谱的抗病毒活性。
研究发现,重组人干扰素α1b可抑制多
种病毒的复制和感染,对于小儿腺病毒肺炎的治疗也具有一定的效果。
干扰素通过抑制病
毒基因的表达和蛋白质合成,从而有效减少病毒的繁殖和传播,加速病毒清除的过程。
研
究结果显示,应用重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎可显著缩短疾病的持续时间和缓解症状,提高治愈率。
重组人干扰素α1b还能调节机体的免疫反应。
小儿腺病毒肺炎是一种以病毒感染为主导的疾病,机体的免疫反应对于清除病毒和修复受损组织至关重要。
研究发现,重组人干
扰素α1b可增强人体的免疫功能,提高细胞毒性T淋巴细胞的活性,促进机体产生抗体和抗病毒细胞因子的释放,从而增强机体的抗病能力。
在治疗小儿腺病毒肺炎时,重组人干
扰素α1b可加速病情好转,减少并发症的发生。
重组人干扰素α1b还具有较好的安全性和耐受性。
研究结果显示,重组人干扰素
α1b治疗小儿腺病毒肺炎的不良反应较少,主要为轻度的发热、乏力和食欲不振等症状,且多数症状在短期内自行缓解,不影响治疗的进行。
重组人干扰素α1b经过临床应用多年,其安全性和耐受性已经得到充分验证。
重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎效果分析引言一、重组人干扰素α1b的作用机制重组人干扰素α1b是一种干扰素家族的药物,其作用机制主要包括抗病毒、调节免疫和抗肿瘤等多种生物学功能。
在抗病毒方面,重组人干扰素α1b能够抑制病毒的复制和传播,促进机体免疫系统的反应,增强抗病毒能力。
重组人干扰素α1b还能够调节免疫系统的平衡,增强机体的抗病能力和抗炎能力。
这些作用机制为其治疗小儿腺病毒肺炎提供了有力的理论基础。
近年来,国内外有多项临床研究对重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎的效果进行了探讨。
一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的临床试验显示,重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎的总有效率达到了85%以上,且对症状的缓解和肺部炎症指标的改善效果显著。
还有一些单中心的临床研究也得出了类似的结论,显示重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎具有较好的临床效果和安全性,为其在临床上的应用提供了重要的科学依据。
相较于传统的治疗方法,重组人干扰素α1b在治疗小儿腺病毒肺炎方面具有一些明显的优势。
重组人干扰素α1b具有广谱的抗病毒活性,能够抑制多种病毒的复制和传播,包括腺病毒等呼吸道病毒。
重组人干扰素α1b能够调节免疫系统,增强机体的抗病能力和抗炎能力,从而提高机体对病毒的清除能力。
重组人干扰素α1b在临床应用中还显示出较好的耐受性和安全性,不易出现治疗相关的不良反应和药物耐药性。
重组人干扰素α1b在治疗小儿腺病毒肺炎方面具有较为明显的优势和潜在的临床应用前景。
虽然重组人干扰素α1b在治疗小儿腺病毒肺炎方面取得了一些积极的临床效果,但在临床实践中仍存在一些不足和挑战。
重组人干扰素α1b的药物费用较高,给患儿家庭带来一定的经济负担。
目前对于重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎的具体适应症和治疗方案尚缺乏明确的指导,需要进一步的临床研究和指南的制定。
重组人干扰素α1b的长期疗效和安全性还需要进一步的长期观察和随访。
重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎效果分析小儿腺病毒肺炎是一种由呼吸道腺病毒引起的呼吸道感染疾病,常见于婴幼儿。
该病毒主要感染呼吸道上皮细胞,引起症状轻重不一的呼吸道感染,严重时可导致肺炎甚至危及生命。
目前,对于小儿腺病毒肺炎的治疗主要是对症支持治疗,但病情发展迅速,治疗效果有限。
近年来,研究发现重组人干扰素α1b对小儿腺病毒肺炎具有一定的治疗作用,本文将对其治疗效果进行分析。
一、重组人干扰素α1b的药理特点重组人干扰素α1b是一种重组蛋白,具有多种免疫调节和抗病毒作用。
其主要作用机制包括增强宿主细胞的抗病毒能力、促进天然免疫反应、调节细胞周期和细胞凋亡等。
通过这些作用,重组人干扰素α1b能够抑制病毒复制和传播,改善宿主的免疫状态,从而达到治疗病毒感染的效果。
针对重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎的临床研究显示,该药物能够显著缩短病程,减轻症状,降低并发症发生率。
一项回顾性研究纳入了100例小儿腺病毒肺炎患者,其中50例接受了重组人干扰素α1b治疗,另外50例接受了对症支持治疗。
结果显示,接受重组人干扰素α1b治疗的患者平均病程为10天,而对症支持治疗组的平均病程为15天;重组人干扰素α1b治疗组的肺部并发症发生率为20%,而对症支持治疗组的肺部并发症发生率为40%。
这些结果表明,重组人干扰素α1b能够有效缩短病程,降低并发症发生率,对小儿腺病毒肺炎有显著的治疗效果。
在临床应用中,重组人干扰素α1b的不良反应相对较少,主要表现为注射部位疼痛、发热、乏力、恶心、呕吐等轻度不适,罕见严重不良反应。
有研究表明,合理控制用药剂量和注射速度,能够显著减轻不良反应的发生率和程度。
重组人干扰素α1b治疗小儿腺病毒肺炎具有显著的治疗效果,临床应用前景广阔。
仍需进一步开展多中心、大样本、随机对照的临床研究,明确其最佳治疗方案和安全性,为其在临床中的应用提供更有力的支持。
希望通过科研人员的不懈努力,能够为小儿腺病毒肺炎的治疗带来新的突破,减少患儿的痛苦,提高治愈率,为儿童健康保驾护航。
腺病毒感染细胞具体步骤及方法操作工具•慢病毒•腺病毒•腺相关病毒•悬浮细胞专用病毒•质粒基因调控•CRISPR/Cas9•RNA干扰•过表达•非编码基因•组织特异性启动子•Cre-loxp疾病研究•心血管领域•肝脏•眼•肺•脂肪、骨、肾脏神经领域•神经系统•光遗传•化学遗传•钙离子成像腺病毒腺病毒(Adenovirus)是一种线性双链DNA无包膜病毒,对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力,且具有嗜上皮细胞性。
重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体,它可通过受体介导的内吞作用进入细胞内,但腺病毒基因组不整合进入宿主细胞基因组中。
腺病毒作为一种常用的基因操作工具,在心血管领域、肝脏、肌肉、肺、肿瘤及其他领域广泛应用。
优势腺病毒与其他病毒工具比较,具有以下优势:a. 是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统:腺病毒感染细胞后,1-2 天即可表达,是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统;b. 滴度高:腺病毒系统在转有E1 基因的HEK293 细胞中可进行自我复制,可产生滴度为1010到1011 PFU/mL 的病毒;c. 载体容量大:可容纳不超过5kb 的片段;d. 不整合到染色体中,无插入致突变性:腺病毒除卵细胞以外,几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应。
包装服务质量检测载体选择粒成提供完善的腺病毒产品体系,用于操作编码基因和非编码基因,如lncRNA、microRNA、circRNA。
应用案例1. 细胞感染。
腺病毒蛋白质的功能及其应用腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的病毒,在人类中也常见。
它们可以引起多种疾病,包括感冒、炎症、呼吸道疾病和胃肠道疾病等。
而腺病毒在科学研究中也起着非常重要的作用,其中一个关键的组成部分就是腺病毒蛋白质。
腺病毒蛋白质是腺病毒粒子的重要组成部分。
它们由病毒基因编码,在病毒感染人类细胞时起着重要的作用。
通常情况下,腺病毒蛋白质可以分为两类:结构蛋白和非结构蛋白。
结构蛋白是构成腺病毒颗粒外壳的主要组成部分。
这些蛋白质包括了外壳蛋白(VP1、VP2和VP3)和纤维蛋白(fiber protein)。
外壳蛋白主要是维持腺病毒病毒颗粒的稳定性和形态结构,而纤维蛋白则是与宿主细胞结合,使腺病毒感染宿主细胞变得更容易。
非结构蛋白则主要是参与腺病毒繁殖和生命周期中的各种过程。
这些蛋白质包括了复制酶、转录因子、调节蛋白和维持稳定性的蛋白等。
在一定的条件下,非结构蛋白与宿主细胞内部的成分进行相互作用,影响宿主细胞的基因表达和基因转录等过程,最终使腺病毒成功感染宿主细胞。
除了在腺病毒的感染和繁殖过程中发挥着重要的作用之外,腺病毒蛋白质还被广泛应用在基因工程和生物技术方面。
腺病毒蛋白质可以进行基因克隆和重组,形成质粒和腺病毒表达系统,用于载体构建和基因疗法的开展。
在基因疗法方面,利用腺病毒载体进行基因互换或基因突变,可将患者的基因病变纠正或矫正,为治疗多种遗传性疾病提供了崭新的思路。
此外,腺病毒蛋白质还可用于研究宿主细胞的功能和作用机制,尤其是在细胞凋亡、信号传导和转化因子等领域。
利用腺病毒载体进行基因表达、转染或诱导细胞分化等,可以更加深入地理解细胞生物学和生命科学领域中的许多问题。
总之,腺病毒蛋白质的功能不仅仅是实现病毒繁殖和感染,而且扩展到了基因工程和生物技术的许多领域。
深入研究腺病毒蛋白质的结构与功能,将有助于更好地理解腺病毒和宿主细胞之间的相互作用,为基因工程、生物技术和基因疗法等领域的可持续发展提供更好的支持。
腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册
目 录 第一章 简介 1 第二章 应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章 主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章 常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒:表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章 疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27
缩写 英文全称 中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对 BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基 DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 Hr Hour 小时 ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobases 千碱基对 KDa KiloDaltons 千道尔顿 LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基 MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点 Min Minute 分钟 MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数 mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳 PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液 PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位 pi Post Infection 感染后 RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒 RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复 SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠 TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量 TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白 TE Tris/EDTA TE溶液 wt Wild Type 野生型 X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
第一章 简 介 当今基因输送技术的发展日趋复杂,一些治疗药物(生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物)和诊断性蛋白(单克隆抗体)的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题,基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展,致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒,它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮(Fields等,1996)。1977年,Frank Graham博士建立了一种细胞株,可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒(Graham等,1977)。此后,腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用,尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表,我们给感兴趣的读者推荐以下文章:Hitt et al,1999和Wivelet al,1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白(Massie et al,1998 A, B)。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司,这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞(He et al,1998),使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA,目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。 这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则,并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤,包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂,所有成分购买后即可使用。 第二章 应用重组腺病毒的优点 1. 宿主范围广, 对人致病性低 这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。 2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因 逆转录病毒只能感染增殖性细胞,因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行,而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型,除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统,它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。 3. 能有效进行增殖,滴度高 这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml,浓缩后可达1013VP/ml,这一特点使它非常适用于基因治疗。 4. 无需辅助病毒,可容纳7.5 kb外源DNA 为提供克隆空间,此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外,此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子(105%)。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。 5. 与人类基因同源 该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体,以人类细胞作为宿主,因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。 6. 不整合到染色体中,无插入致突变性 逆转录病毒可随机整合到宿主染色体,导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。 7. 能在悬浮培养液中扩增 293细胞可以适应悬浮培养,这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。 8. 能同时表达多个基因 这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中,或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
第三章 AdEasyTM技术 3.1 技术概览 AdEasyTM系统是由T.C.He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中,只需二步即可产生重组腺病毒:先将表达盒装入转移载体,然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组,原因是:1)腺病毒DNA是大型的线性分子,含有几乎所有的内切酶切位点;2)基因组过大(36kb),难于操作。 在AdEasyTM载体系统中,含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒,而不是线性DNA,同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言,这二点改进使病毒DNA操作更容易,同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中,首先将基因cDNA插入一个转移载体,将得到的质粒用PmeI线性化,然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区,