重组腺病毒生产技术研究进展

凋亡素基因重组腺病毒的构建【摘要】目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体，为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。

方法 Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack CMV VP3，然后电转化到BJ5183AD1细胞中进行同源重组。

PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒，运用RT PCR鉴定重组腺病毒。

用氯化铯梯度离心纯化病毒。

用物理和生物方法确定病毒的滴度。

结果 PacⅠ酶切证实同源重组成功。

绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力，RT PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。

重组腺病毒的浓度为84.52×109 VP/ml，滴度为6.561×109 PFU/ml。

结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒，它的滴度足以满足体内外实验。

【关键词】凋亡素基因腺病毒载体基因治疗【Abstract】Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle vector pAdTrack CMV VP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD 1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin geneof the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where the recombinant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RTPCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination. Green fluorescence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RT PCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52×109 VP/ml and 6.561×109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vector containing Apoptin gene is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment.【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy凋亡素，又称Apoptin(apoptosis induction)［1］，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。

腺病毒载体的研究进展与展望
袁子国;张秀香;高胜言;徐慧娟;扈荣良
【期刊名称】《吉林畜牧兽医》
【年(卷),期】2008(029)001
【摘要】随着重组技术在生物领域上的应用,病毒活载体疫苗的研制成为基因工程疫苗研制的热点,其中,腺病毒由于其具有独特的优势,成为疫苗载体应用中的不可缺少部分,本文就腺病毒载体的研究进展作一简要综述,旨在为其进一步应用提供参考依据.
【总页数】3页(P13-14,17)
【作者】袁子国;张秀香;高胜言;徐慧娟;扈荣良
【作者单位】军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林长春,130062;吉林大学,畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学,畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林农业大学,生命技术学院,吉林长春,130118;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林长
春,130062;军事医学科学院,军事兽医研究所,吉林长春,130062
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
【相关文献】
1.腺病毒及腺病毒载体的研究进展 [J], 金天明;武迎红
2.腺病毒载体研究进展与展望 [J], 祝秀梅;慕洪涛;王凡;吕志慧;马全英;刘学荣;黄银君;牟克斌
3.人类腺病毒载体介导的基因治疗研究进展与展望 [J], 张德礼
4.人类腺病毒载体疫苗及其免疫研究进展与展望 [J], 张德礼
5.腺病毒载体介导的人肺囊性纤维化基因治疗的研究进展与展望 [J], 张德礼;高显明
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作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。

为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。

本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。

1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。

编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。

非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。

第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。

其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。

但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。

在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。

此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。

2004 年 10月The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2004重组腺病毒生产技术研究进展祁丽，顾铭，丛威(中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室，北京 100080)摘要：目前基因治疗，尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术的发展，对癌症在基因水平上的认识不断深化，发现了很多对治疗癌症有帮助的基因，但临床面临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统，将这些治疗基因有效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展.关键词：基因治疗；重组腺病毒载体中图分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)05−0475−061 前言基因治疗是近年来兴起的一种针对单基因和多基因遗传病、心血管疾病、恶性肿瘤和一些传染病的新的治疗模式，目的是将外源治疗基因导入靶细胞，在体内产生疗效. 基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统. 到目前为止，病毒载体在基因治疗中仍然是最有效的基因导入系统[1]. 腺病毒就是已经用于基因治疗的载体之一，与其它病毒载体相比，腺病毒载体一个主要优势是在包装细胞中能获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞，目前应用最多的是Ad5[2]. 用外源DNA置换出一定长度的病毒基因片断及获得重组的腺病毒，根据腺病毒载体中的病毒基因置换程度，可将其分为第一代、第二代和第三代. 第一代腺病毒载体去除了基因序列中的E1和E3区，包装外源基因的能力较小，在8.5 kb以内，主要用于单基因疾病的治疗[3]，缺点是导入基因的表达时间短和引起宿主的免疫反应，导致直接的细胞致病变作用(Cytopathic Effects，CPE)，另外，在293细胞内同源重组作用导致野生腺病毒(Replicative Competent Adenovirus，RCA)的产生[4]. 为了避免上述缺点，第二代腺病毒载体进一步去除了E2a, E2b或E4，载体的容量和安全性比第一代有所改进，但是其介导的外源基因的转染和表达时间并没有明显延长，而且产生重组病毒滴度低，另外保留的病毒基因仍有低水平的表达并引起细胞免疫反应[5,6].第三代腺病毒缺失全部或大部分腺病毒基因，或者包装腺病毒微染色体系统，这种载体缺失了病毒蛋白，所以很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难. 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体.重组腺病毒的生产过程主要包括包装细胞的培养、病毒感染、病毒的分离纯化和病毒计数及滴度测定等几个主要步骤. 以下从腺病毒的感染机制、生产和纯化计数几个方面论述重组腺病毒载体的生产技术.收稿日期：2003−09−28，修回日期：2003−11−05基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(编号: 2001AA217121)作者简介：祁丽(1979−)，女，河南省原阳县人，硕士研究生，生物工程专业；丛威，通讯联系人，E-mail: weicong@.2 腺病毒感染机制野生腺病毒的基因组双链DNA长度为36 kb[1]. 腺病毒感染细胞主要有以下几个步骤：(1) 病毒的扩散与在细胞表面吸附. 这一步中细胞密度、直径、培养基粘度和组成是比较关键的参数；(2) 病毒颗粒与细胞膜特异受体结合后经内吞作用进入细胞，随即脱衣壳，病毒DNA进入细胞核中，这一步非常快，大约在10 min之内[7]；(3) 基因转录与病毒DNA复制，这一步又可以分为几部分，0∼2 h，E1区的转录，E1区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有调控作用，2∼6 h，早期转录区基因E1b, E2a, E2b, E3, E4的转录，这些基因的功能是控制宿主细胞的代谢和病毒DNA复制，有报道[8]证实感染6∼8 h后宿主细胞的DNA复制完全停止，用含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体感染细胞后6 h即可在线检测到报道基因的表达，20 h后达到最大表达量[9,10]，说明病毒基因的复制与翻译在20 h时就已经完成.3 宿主细胞感染腺病毒后的代谢变化细胞感染腺病毒后，细胞干重、蛋白和DNA含量、细胞大小都有不同程度的增加，如293细胞在不含血清的培养基中，细胞感染病毒后直径从15 µm增至17 µm[10]. 在感染24∼48 h后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了30%∼100%[11,12], O2的消耗和ATP的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量[13].4 重组腺病毒的生产方法生产重组腺病毒通常所使用的细胞系有贴壁依赖性细胞和悬浮培养细胞，目前使用最广的是293细胞(人胚胎肾细胞)，使用这一细胞的优点是可以获得很高的病毒滴度，缺点是由于同源重组能产生野生型腺病毒. 一些实验室建立了293悬浮培养细胞系，还有在293细胞的基础上建立了911细胞[14]. 另一个较常用的是PER.C6®(人胚胎视网膜)细胞 [15],这个细胞株最大程度地减少了野生型腺病毒的产生几率，但是该细胞已经申请了专利，使用该细胞株必须获得授权.另外已经构建的A549细胞(肺癌细胞系)可以包装E1区缺陷的腺病毒，同时降低了野生腺病毒的产生几率[16]. 以下从使用的细胞系分别说明重组腺病毒的生产方法.4.1 贴壁依赖型细胞通常贴壁依赖型细胞培养方法是用方瓶和转瓶，也可以在搅拌条件下使用微载体进行培养. 贴壁依赖型细胞一般用于细胞外分泌蛋白的工艺，当用于腺病毒载体的培养时，只能收集细胞后再进行破碎使腺病毒释放到介质中，但是这种方法由于贴附表面的限制放大比较困难，而且培养基中的血清增加了对下游分离纯化工艺的要求.通常在贴壁培养条件下293细胞的接种密度大约在(1∼1.5)×104个/cm2，当细胞增殖到105个/cm2时接种病毒，贴壁培养的细胞比悬浮培养的细胞病毒产率要高一些，前者为7000∼12000 pfu/细胞，后者为5000 pfu/细胞. 但是由于贴壁面积的限制，总的病毒产量要低于悬浮培养[17].微载体对贴壁依赖型的细胞提供了更大的贴附表面积，Nadeau[17]评价了293细胞在不同的微载体系统的生长状况，认为Cytodex−3相对于其它的微载体是最优的. 但是293细胞本身的贴壁能力很弱，细胞很难在微载体间进行迁移.4.2 悬浮培养细胞相对于贴壁培养，悬浮培养更适于培养规模的放大，目前，对贴壁依赖型细胞进行改良，已第5期祁丽等：重组腺病毒生产技术研究进展477经建立了几种适于悬浮培养的细胞，如293，PER.C6®. 同时，无血清培养基的开发使得下游的分离纯化更容易.在批式悬浮培养中，293细胞和PER.C6®的最终细胞密度都可以达到3×106个/mL[12]，有些报道称293细胞的最终密度可达(7∼9)×106个/mL[18]. 批式培养操作比较简单，不用流加物质，所以染菌的机会较少. 在病毒感染后营养消耗很大，所以为了获得较高的病毒滴度，接种病毒后需要更换新鲜培养基.灌注可以提高细胞密度，也可以用于腺病毒的生产，灌注培养条件下，PER.C6®的最终细胞密度可以达到(7∼8)×106个/mL，也有人[19]建议用灌注的方法使细胞保持在很高的密度和营养状态，再进行病毒接种.表1列出了一些利用293细胞生产腺病毒的生产工艺数据和参数. 其中给出了用293细胞生产腺病毒载体常用的方法，除了用微载体培养外都是悬浮培养. 在进行病毒感染时除流加和灌注培养方式外，大部分方法都要更换培养基，保证包装病毒过程的营养需要. 在测定病毒产量时采用了不同的方法，所以，最终产量的表示方式不一样.表1 293细胞生产重组腺病毒载体的参数及数据Table 1 Data for production of adenovirus by cell 293Method V olume(L)MediaInoculation(×104 cell/mL)Infection(×105 cells/mL)MOI1)Harvest(d)Virus yield(×103 cell−1)Batch 3IS293-SF432110625vp Batch sparged[17] 3 IS293-SF 3 7.2 10654vpBatch cyto-3[20]2∼4 DMEM+10%FBS2)15 19∼22 5∼10 2∼3 3.6∼7.3 pfuBatch uspension[17] 2 293-SFMII 20 10 102 5.6ipFed-batch suspension[13] 3.5 NSFM13 30 10 10 2 1.6ip Perfusion suspension[12]0.5 DMEM+5%FBS 30 60 5 2.5 1.3ip/mLPerfusion suspension[13]10 293-SFMII 50 50 10 2 1.5ip/mLNote: 1) Multiplicity of infection; 2) Fetus bovine serum.5 重组腺病毒的纯化和计数方法重组腺病毒的纯化是大规模生产中的关键问题，病毒最经典的纯化方法是CsCl密度梯度离心，但是，这一工艺耗时并且放大困难. 为了满足基因治疗的需要，建立适用于大规模生产的纯化技术非常必要. Shabram等[21]使用了两步法，首先将粗提液通过DEAE阴离子交换柱，再通过羟基磷灰石柱进行吸附，这种方法是用于分离Ad2的，直接用于Ad5的分离需要改变分离的条件.Huyghe等[22]实验了阴离子交换树脂、体积排阻色谱、疏水色谱和固定化锌吸附色谱(ImmobilizedZinc Affinity Chromatography, IZAC)四种方法，总结出的优化方案为先通过DEAE阴离子交换柱，再通过固定化锌吸附色谱(IZAC)柱.在生产过程中病毒颗粒数和病毒滴度是两个非常关键的参数，这二者又与构建的病毒种类和宿主细胞种类有密切的关系. 准确的计数病毒可以检测纯化工艺的可靠性，通常所用的方法是生物检测，但是生物检测耗时长，操作复杂，而且对实验条件要求高，人为造成的误差大. 最早Maizel等人使用了OD260的方法，用SDS处理病毒后在260 nm测定其吸光度，再乘以消光系数就可以得到病毒颗粒数. 但是这一方法的精确度不能满足临床治疗的需要[21]. 为了满足临床的需要，人们尝试了各种方法. 表2列举了一些腺病毒的计数方法.其中病毒颗粒数包括具有感染效力的病毒和不具感染效力的病毒，在临床应用中一般采用总颗粒数来计算病人的接受剂量. 病毒滴度的测定是观察细胞感染病毒后的感染斑，是对具有感染效478 过 程 工 程 学 报 第4卷 力的病毒的测定，为了保证临床应用的正确性，应该知道二者的比例，所以两种测定方法都非常关键. 感染滴度的测定与使用的生物材料和操作条件有密切的关系[28]. 由于病毒受到培养基体积的影响并不能充分感染细胞[27]，空斑法测定的结果偏低. 野生腺病毒的出现在临床应用中是非常危险的，从安全的角度出发，对它的检测非常关键.表2 常见的腺病毒载体计数方法Table 2 Common methods used for adenovirus quantitationTotal particle (vp)Titre (IU) RCAs Plaque assay Plaque assay and PCR TCID50 [28] Green fluorescent protein [29] OD 260Continuous bed matrix-HPLC [23]RP-HPLC [24]AE-HPLCPicoGreen fluorescent dye [25]Capillary zone electrophoresis [26]Electron microscope6 质量控制生产过程中野生腺病毒数的测定非常关键，通常是用敏感细胞的细胞致死效应来测定，比如：hela 细胞和A −549细胞，但是这种测定方法周期长，通常需要28 d. 现在更灵敏的方法是PCR.野生腺病毒的出现也促使人们去寻找更可靠的包装细胞株，如PER.C6®，但应用更多的还是293细胞. 对重组腺病毒的质量控制贯穿于整个生产纯化工艺，包括包装细胞、病毒、粗分离产品、纯化产品和最终产品. Roitsch 等[30]从稳定性、有效性和纯度三个方面详细报道了基因治疗中重组腺病毒的质量控制手段. 稳定性包括病毒基因组的稳定性和治疗基因表达的稳定性，前者的检测用酶切、电泳和Southern blot 等方法，后者的检测用ELISA 法. 有效性包括总病毒颗粒数与病毒滴度之间的比例和具有感染效力的病毒颗粒中治疗基因有效表达的比例，在临床治疗中病人接受的剂量用病毒总颗粒数表示，所以，上述两种比例就显得尤为重要，其中总颗粒计数用AE −HPLC 法，病毒滴度测定用免疫荧光法，外源基因表达检测用ELISA 法. 纯度包括RCAs 的检测、杂蛋白污染检测，RCAs 的检测用生物法和PCR 法，杂蛋白污染的检测用反相HPLC 和MALDI −TOF 质谱联用法.7 发展趋势与存在问题在过去几年中，新的腺病毒载体不断研制成功，对腺病毒载体的大规模生产工艺提出了迫切的要求. 尽管面临着很多困难，人们尝试了各种方法，通过腺病毒载体生产方式的改进，使重组腺病毒的大规模生产成为可能. 首先，随着各种适合悬浮培养的培养基的出现，从传统的贴壁细胞生产方式转向利用悬浮细胞培养方式；其次，另一个重要转变就是生产过程中无血清培养基的应用，传统的血清培养方式给下游的分离纯化工艺造成很大的困难，无血清培养基的应用大大简化了下游的纯化工艺；第三就是培养方式的改变，从批式培养到流加和灌注方法的应用，克服了细胞达到一定浓度后的营养缺乏，减少了副产物的产生. 总之，包装细胞的培养工艺逐渐转向无血清悬浮灌注培养方式，以增加细胞密度，提高病毒产量.由于目前大量的研究主要集中在包装细胞的培养工艺和腺病毒的纯化计数方法，对病毒在宿主细胞中的DNA 复制和成熟的机制知之甚少，最终提高病毒的产率和滴度以及完善流加和灌注工艺还有赖于对病毒复制与成熟机制的了解.第5期祁丽等：重组腺病毒生产技术研究进展479在整个重组腺病毒的生产纯化工艺中，纯化计数以及质量控制是比较薄弱的环节. 目前，虽然探索了不少的纯化计数方法，但是其中所用到的设备和材料价格昂贵，所以还有待进一步开发适合大规模纯化要求的设备和材料，或成本低廉的纯化工艺. 质量控制是生产中非常重要的一环，它应该包括两方面的内容，首先，它不仅是对最终产品质量的把关，还应该贯穿在整个生产过程中；其次，国内目前对于应用在临床的重组腺病毒载体还没有颁布相应的质量标准，甚至发达国家相关的质量标准也还很不完善，所以在质量标准的制定方面应加大研究力度，从而提高产品的治疗效果，减少副作用的发生.参考文献：[1] 顾健人，曹雪涛. 基因治疗 [M]. 北京：科学出版社, 2001. 1−54.[2] Trapnell B C. 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To meet the need of experimental and clinical applications, 293 cell lines which include adherent cell line and suspension cell line are frequently used in production. Methods used in production include batch, fed-batch and perfusion. Quality control of recombinant adenovirus vectors is also very important in the process of production. This review summarizes the production process of adenovirus vectors, mainly concentrated on the adenovirus infection mechanism and methods of production, purification and quantification.Key words: gene therapy; recombinant adenovirus vector。

人类腺病毒分子生物学研究进展及病毒治疗人类腺病毒是一种常见的呼吸系统病毒，它可以引起婴儿和幼儿的上呼吸道感染。

尽管腺病毒感染通常不会导致严重的健康问题，但仍然有一些人会出现严重症状，例如肺炎、支气管炎等。

为了防止儿童患上腺病毒感染，人们经常会接种腺病毒疫苗。

然而，由于该病毒有多种变异株，目前的疫苗并不能涵盖所有的变异株。

因此，对人类腺病毒分子生物学的研究至关重要，这将帮助科学家更好地理解该病毒的特性，从而开发更有效的治疗方法。

一、人类腺病毒的分子生物学研究进展人类腺病毒属于腺病毒科，是一种非常小的病毒，其大小大约为20-30纳米。

尽管它的尺寸很小，但该病毒的体内基因组却非常大，其基因组长约30kb。

根据研究，人类腺病毒的基因组中含有31个基因，其中28个是编码蛋白质的基因，剩下的3个则是非编码RNA基因。

在分子生物学研究中，科学家发现，人类腺病毒的核心部分由四种结构蛋白组成，这四种蛋白分别是：VP1、VP2、VP3和VP4。

其中，VP1、VP2和VP3蛋白对于病毒的抗原性非常重要，病毒的一些变异也是由于这三种蛋白的突变引起的。

此外，人类腺病毒的分子生物学研究还揭示了该病毒的复制机制。

具体来说，人类腺病毒需要依赖于细胞内的一些分子才能够进行复制。

首先，它必须将其基因组导入宿主细胞内，使其与细胞核融合。

然后，病毒基因组中的mRNA会通过转录和翻译被转化为蛋白质。

最终，这些蛋白质会合成新的病毒颗粒，进而释放入细胞外界。

二、病毒治疗的发展除了研究人类腺病毒的分子生物学特性外，科学家还在尝试开发针对该病毒的病毒治疗方法。

病毒治疗是一种利用病毒技术来治疗疾病的方法，与传统的药物治疗相比，它具有更准确的作用、更低的毒副作用等优点。

下面将介绍一些目前正在研究的腺病毒病毒治疗方法。

1.利用基因工程技术改良病毒近年来，随着基因工程技术的发展，科学家开始研究利用该技术来改造人类腺病毒的基因组，以使其成为更为安全和有效的病毒疫苗。

衡阳师范学院毕业论文（设计）题目：腺病毒载体研究进展所在系：生命科学系专业：生物科学学号：09300123作者姓名：彭赞平指导教师：杨海2013年5 月18 日衡阳师范学院毕业论文（设计）任务书衡阳师范学院本科生毕业论文（设计）开题报告衡阳师范学院毕业论文（设计）附件题目：腺病毒载体研究进展所在系：生命科学系专业：生物科学学号：09300123作者姓名：彭赞平指导教师：杨海2013年 5 月12日腺病毒载体研究进展生命科学系生物科学专业09300123彭赞平指导老师：杨海老师摘要：腺病毒因具有易感染性、宿主范围广、毒性低、使用安全、容纳量大、非整合性等特点,使得腺病毒载体成为基因转移中最有前途的基因载体之一。

但由于腺病毒载体在体内靶向性差、免疫原性强、半衰期短，限制了其在基因治疗中的作用。

为解决上述问题，可对腺病毒载体的衣壳蛋白进行遗传改造或表面修饰。

本文对腺病毒及腺病毒载体的研究进展做一简要综述，为进一步优化和改良腺病毒载体提供参考。

关键词：腺病毒；腺病毒载体；研究进展目录1 腺病毒的基本结构 (1)2 腺病毒的感染机理 (1)2.1 识别与粘附 (1)2.2基因组的转录 (2)2.3基因组复制 (2)2.4病毒颗粒的组装 (3)3腺病毒载体的构建 (3)3.1腺病毒载体的构建原理 (3)3.2腺病毒载体的构建方法 (4)3.2.1体外连接法 (4)3.2.2同源重组法 (4)4腺病毒载体的发展历程 (5)5腺病毒载体的应用 (7)6腺病毒载体的不足 (8)7腺病毒载体的改良与修饰 (8)7.1腺病毒PEG化 (9)7.2腺病毒衣壳的共价修饰 (9)8展望 (10)致谢 (11)参考文献 (12)1 腺病毒的基本结构腺病毒无囊膜，直径约70-90nm，呈二十面体立体对称[1]。

腺病毒含有一个大小在36kb左右线形双链DNA分子（Ad-DNA），两端具有末端反向重复序列（inverted terminal repeat，ITR），长103-162bp。

腺相关病毒载体的研究进展摘要：目的：本论文旨在综述腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗领域的研究进展，探讨其在治疗和潜在应用方面的最新发展。

方法：通过查阅相关文献，收集和整理了与腺相关病毒载体有关的研究成果，并结合国内外相关研究进行分析。

结果：在基因治疗方面，腺相关病毒载体已被广泛应用于遗传性疾病、癌症和神经系统疾病等的治疗。

不仅可以有效传递修复基因，还可以调节基因表达，并显示出良好的生物安全性和耐受性特性。

另外，在免疫治疗方面，腺相关病毒载体可用于疫苗开发和免疫调节，提供了一种新的治疗策略。

腺相关病毒载体的研究工作也包括载体优化、体内外评价和治疗效果验证等方面。

结论：腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗方面展现出了巨大的前景和潜力。

通过持续的研究和优化，它们有望成为治疗遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病的有效工具。

然而，仍然需要进一步的研究来解决其在临床应用中可能存在的问题，并确保其安全性和有效性。

关键词：腺相关病毒载体；基因治疗；免疫治疗引言腺相关病毒载体作为基因治疗和免疫治疗的工具，在疾病治疗和防控领域具有巨大的潜力。

本文通过综述相关文献，总结和讨论了腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗方面的研究进展。

这些载体已被广泛应用于遗传性疾病、癌症和神经系统疾病等的治疗，并取得了显著效果。

此外，腺相关病毒载体具有良好的生物安全性和耐受性特性，为治疗提供了更大的安全性和可行性。

在免疫治疗方面，腺相关病毒载体可以用于疫苗开发和免疫调节，为免疫治疗提供新的策略。

然而，仍需进一步研究和探索，以优化腺相关病毒载体的性能和应用。

1资料与方法1.1一般资料本文所使用的资料主要包括相关的研究文献、学术论文和专业书籍。

这些资料覆盖了腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗领域的研究进展、应用案例、载体优化技术等方面的内容。

通过对这些资料的收集、整理和分析，我们可以全面了解和评估腺相关病毒载体的研究进展。

1.2方法通过在学术数据库（如PubMed、Web of Science等）中进行关键词搜索，选择相关的研究文献和学术论文。

第32卷第5期2010年10月　　大连医科大学学报J o u r n a l o f D a l i a n Me d i c a l U n i v e r s i t y　V o l.32N o.5O c t.2010腺病毒及其研究进展陈娜娜,向冬喜,郑丛龙(大连大学医学院病原生物学教研室,辽宁大连116622)摘要:本文从腺病毒的分类、结构和受体等方面对腺病毒进行了介绍,同时对腺病毒的感染和致病性做了综述,并进一步介绍了抗腺病毒治疗研究进展和腺病毒载体的应用。

对腺病毒多方面进行较全面的了解,有助于促进抗腺病毒药物的研发和加强腺病毒载体在基因治疗中得到更好的应用。

关键词:腺病毒;感染性;致病性;治疗;载体中图分类号:R373.1 文献标志码:A 文章编号:1671-7295(2010)05-0586-05A d e n o v i r u s a n d i t s r e s e a r c h p r o g r e s sC H E NN a-n a,X I A N GD o n g-x i,Z HE N GC o n g-l o n g(D e p a r t m e n t o f P a t h o g e n y B i o l o g y o f M e d i c a l C o l l e g e,D a l i a n U n i v e r s i t y,D a l i a n116622,C h i n a)A b s t r a c t:T h e c a t e g o r y,s t r u c t u r e a n dr e c e p t o r o f a d e n o v i r u s a r e i n t r o d u c e di nt h i s a r t i c l e.I t a l s o d e s c r i b e st h ei n f e c t i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o f a d e n o v i r u s.F u r t h e r m o r e,t h e r e s e a r c hp r o g r e s s o f a n t i-a d e n o v i r u s t h e r a p y a n dt h e a p p l i c a t i o no f a d e-n o v i r u s v e c t o r a r e r e v i e w e d.W i t h t h e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f a d e n o v i r u s,i t i s h e l p f u l t o p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f a n t i-a d e n o v i r u s m e d i c i n e a n dt h ea p p l i c a t i o n o f a d e n o v i r u s v e c t o r i n g e n e t h e r a p y.K e yw o r d s:a d e n o v i r u s;i n f e c t i o n;p a t h o g e n i c i t y;t h e r a p y;v e c t o r 腺病毒(A d e n o v i r u s)是从手术切除的扁桃体组织分离培养得到的一种D N A病毒,主要在细胞核内繁殖,常引起人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。

腺病毒载体及其在血液病基因治疗中的应用和研究进展
魏旭东
【期刊名称】《国外医学：输血及血液学分册》
【年(卷),期】2000(023)001
【摘要】本文主要包括腺病毒载体的研究进展，如腺病毒载体的构建、原理和优点，同时对以腺病毒为载体对血液系统疾病的实验室研究，如含ＥＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＰＯ重组腺病毒在血液病治疗的应用及腺并不是载体对血友病、白血病治疗，以及对正常血细胞白血病细胞垢感染情况。

【总页数】3页(P11-13)
【作者】魏旭东
【作者单位】北京医科大学人民医院电镜室
【正文语种】中文
【中图分类】R552.05
【相关文献】
1.腺病毒载体在基因治疗中的应用进展 [J], 王俊伟
2.腺病毒载体在基因治疗中的应用进展 [J], 王俊伟
3.腺病毒载体在基因治疗研究中的应用 [J], 李爱玲
4.腺病毒载体纯化及在肿瘤基因治疗中的应用 [J], 庞小娟;李晓军;秦浚川
5.腺病毒载体在肿瘤基因治疗和基因疫苗领域的应用研究进展 [J], 谢谦;高祥;王祎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。