③TK基因突变试验

遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。

根据检测的遗传学终点分为4种类型:1检测基因突变（比如：Ames试验）;2检测染色体畸变（比如：微核试验）;3检测染色体组畸变（比如：体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验）;4检测DNA原始损伤（比如：单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)）。

以上检测结果为呈阳性（除外假阳性）的化合物，为潜在人类致癌剂和/或致突变的物质。

FDA于2006年制定了遗传毒性试验结果的综合分析法指导原则（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetict oxicologystudyresults）对遗传毒性试验的阳性结果评价和处理：ICHS2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。

目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。

1 现行组合试验方案，用一组试验配套进行试验。

200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。

目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。

2 各类遗传毒性试验方法的研究进展2.1 检测基因突变2.1.1 Ames试验Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。

常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。

目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。

测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。

第六章保健食品安全性毒理学与功能学评价研究学习目的把握保食品安全评价基本方法:握保健食品功能评价方法及一盘要求;热保使食晶安全性与功诉价的一般要求;了保食品安全性与功能评价的相技术規范。

学习要点保健食品毒理学评价原则、试验阶段与试验原、试内容与结果判定原则;保食品功能评价方法的一般要求。

第一节保健食品安全性毒理学与功能学评价一般要求保健食品的评价，包括毒理学评价，功能学评价和卫生学评价。

保健食品声称具有保健功能.应当具有科学依据，不得对人体产生急性、亚急性或者慢性危害。

这是对保健食品的基本要求。

首先，保健食品所声称的保健功能应当具有科学依据要建立在科学研究的基础上，有充足的研究数据和科学共识作为支撑，不能随意声称具有保健功能。

其次，保健食品应当保证安全性，保健食品不得对人体产生任何健康危害。

保证保健食品安全性应该从以下三个方面考虑:D保健食品所使用的原料应当能够保证对人体健康安全无害，符合国家标准和安全要求:②国家规定不可用于保键食品的原料和辅料、禁止使用的物品等不得作为保健食品的原料和辅料③依法注册的保健食品，注册时应当提交保健食品的研发报告、安全性和保健功能评价等材料及样品，并提供相关证明文件;依法备案的保健食品，备案时应当提交表明产品安全性和保健功能材料。

在本章中将介绍与保健食品安全性相关的保健食品原料要求、保健食品安全性评价方法、，食品安全毒理学评价程序及方法，与保健食品功能性相关的功效评价原则及方法。

保健食品的卫生评价则与普通食品相似，这里不再赘述。

新修订的保健食品原料目录中，已将单一物质的名单扩充为包括原料名称、用量和对应的功效的完整目录，以保障产品的安全和保健功能。

保健食品的用量是指保证保健食品安全性和具备相应保健功能应当达到的最低和最高限量。

功效是指保健食品原料在一定用量下的功效。

原料或者用量的改变都有可能导致功效的改变。

部分普通食品原料纳入了保健食品原料目录，保健食品原料目录中不仅规定了原料名称，还规定了原料的用量和对应的功效。

基因突变检测内容介绍基因突变检测是一种通过分析个体基因组中的突变，来了解个体是否携带有害突变或遗传疾病的方法。

本文将详细探讨基因突变检测的相关内容，包括检测方法、应用领域、优势和限制等，旨在帮助读者全面了解基因突变检测的重要性和应用前景。

一、基因突变检测方法基因突变检测有多种方法，包括单倍型分析、酶切位点变异分析、测序技术和PCR扩增等。

这些方法根据突变类型和检测需求的不同，选择不同的策略来进行基因突变分析。

1. 单倍型分析单倍型分析是通过检测个体基因组上的特定位点的单倍型（allele）来确定基因型。

常用的单倍型分析方法包括限制性片段长度多态性（RFLP）和序列特定引物扩增（SSP）。

这些方法通常用于检测单个核苷酸多态性（SNPs）或小片段的插入/缺失等突变。

2. 酶切位点变异分析酶切位点变异分析是通过检测特定基因上的酶切位点是否发生变异来判断个体是否存在突变。

这种方法常用于检测大片段插入/缺失和染色体重排等结构变异。

在此方法中，关键是选择合适的酶切位点和适当的酶切酶进行检测。

3. 测序技术测序技术是最常用的基因突变检测方法之一。

通过对整个基因组或特定基因进行测序，可以检测到基因组中所有可能的突变类型。

目前，常用的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（NGS）和单分子测序等。

4. PCR扩增PCR扩增是一种常用的突变检测方法，通过特定序列的扩增来检测基因组中的突变。

PCR扩增可以用于检测单个核苷酸多态性、小片段插入/缺失以及基因的重复序列等突变。

此外，PCR扩增也可用于基因组的特定区域富集，以便后续测序分析。

二、基因突变检测的应用领域基因突变检测在医学、生物学和遗传学等领域有着广泛的应用。

下面将分别探讨其在这些领域中的具体应用。

1. 医学应用基因突变检测在医学中的应用非常广泛。

它可以用于遗传性疾病的诊断和预测。

通过检测个体基因组中与特定疾病相关的突变，可以及早发现患者的病情并制定相应的治疗方案。

小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK基因突变试验1.目的：在正式试验开始之前需要确定供试品的溶解性并确定适宜的供试品剂量范围。

2.剂量：剂量设计试验通常不考虑供试品的溶解性，分别在有和无S9的情况下接受3小时处理，最高浓度可达5mg/ml（即使其溶解度大于5mg/ml，也就是说这是最大的剂量）；以2倍稀释度向下设6－10个剂量。

3.溶剂：溶剂的选择按其优先顺序依次是RPMI-0、生理盐水、蒸馏水和DMSO，要尽量避免悬浮液，如果供试品不可溶，应用RPMI-0将其制成悬浮液。

4.方法：4.1 收集细胞。

细胞总量应达到6×107个，用RPMI-10培养基悬浮备用。

（收集过程中每天应调整细胞的细胞量为2×105/ml，）。

4.2 将10ml RPMI-10培养基（约含107个细胞）分别置于一系列50ml一次性消毒离心管中。

为使处理用培养基中血清含量降至5％（V/V），RPMI-0、溶剂、供试品、1mlS9混合物（代谢活化系统时）或150mMKCL（非代谢活化系统时）加入离心管的总体积应达到20ml（如表所示）。

表处理时培养基的组成成分成分体积无活化系统有活化系统细胞悬液（106/ml RPMI-10）10ml(107个细胞) 10ml(107个细胞)RPMI-0 8.8ml 8.8mlS9混合物－1ml150 mM KCL 1ml --供试品0.2ml 0.2ml将离心管塞紧并置于振荡器上，37℃水浴3小时。

然后低速离心（1000r.p.m）5分钟，弃去上清液，用PBS(PH7.4)洗涤细胞两次。

重新悬浮细胞于50mlRPMI-10之中，并调整细胞密度为2×105/ml，,转移至培养瓶中。

培养2 天。

每天计数细胞生长（DCG），并调细胞密度为2×105/ml左右。

5. 结果按第1d、第2d的DCG计算相对悬浮生长（RSG）.选择10％－20％RSG作为诱变试验的最高剂量，并以2倍稀释度向下设2－5个剂量。

小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK基因突变试验1.目的：在正式试验开始之前需要确定供试品的溶解性并确定适宜的供试品剂量范围。

2.剂量：剂量设计试验通常不考虑供试品的溶解性，分别在有和无S9的情况下接受3小时处理，最高浓度可达5mg/ml（即使其溶解度大于5mg/ml，也就是说这是最大的剂量）；以2倍稀释度向下设6－10个剂量。

3.溶剂：溶剂的选择按其优先顺序依次是RPMI-0、生理盐水、蒸馏水和DMSO，要尽量避免悬浮液，如果供试品不可溶，应用RPMI-0将其制成悬浮液。

4.方法：4.1 收集细胞。

细胞总量应达到6×107个，用RPMI-10培养基悬浮备用。

（收集过程中每天应调整细胞的细胞量为2×105/ml，）。

4.2 将10ml RPMI-10培养基（约含107个细胞）分别置于一系列50ml一次性消毒离心管中。

为使处理用培养基中血清含量降至5％（V/V），RPMI-0、溶剂、供试品、1mlS9混合物（代谢活化系统时）或150mMKCL（非代谢活化系统时）加入离心管的总体积应达到20ml（如表所示）。

表处理时培养基的组成成分成分体积无活化系统有活化系统细胞悬液（106/ml RPMI-10）10ml(107个细胞) 10ml(107个细胞)RPMI-0 8.8ml 8.8mlS9混合物－1ml150 mM KCL 1ml --供试品0.2ml 0.2ml将离心管塞紧并置于振荡器上，37℃水浴3小时。

然后低速离心（1000r.p.m）5分钟，弃去上清液，用PBS(PH7.4)洗涤细胞两次。

重新悬浮细胞于50mlRPMI-10之中，并调整细胞密度为2×105/ml，,转移至培养瓶中。

培养2 天。

每天计数细胞生长（DCG），并调细胞密度为2×105/ml左右。

5. 结果按第1d、第2d的DCG计算相对悬浮生长（RSG）.选择10％－20％RSG作为诱变试验的最高剂量，并以2倍稀释度向下设2－5个剂量。

基因突变检测的原理与应用随着科技的发展，人们对于基因突变的研究越来越深入。

基因突变检测作为一项重要的技术手段，旨在揭示人类遗传病的发生机制、预测药物反应性和制定个性化治疗方案。

本文将介绍基因突变检测的原理与应用，并分析其在医学领域的重要性。

一、基因突变检测的原理基因突变是指细胞的遗传物质DNA中发生的改变，可能导致蛋白质结构和功能异常。

基因突变检测的原理主要包括以下几个方面：1. 核酸提取：从样本中提取出总的核酸物质，包括DNA、RNA等。

核酸提取是基因突变检测的关键步骤，确保后续实验的准确性和可靠性。

2. 聚合酶链式反应（PCR）：通过PCR技术，可以扩增特定区域的DNA片段，增加其浓度，为后续的测序和分析提供充足的材料。

3. DNA测序：通过DNA测序技术，可以逐个碱基地确定给定DNA片段的序列。

这是基因突变检测的关键步骤，能够准确地检测出突变的存在与类型。

4. 数据分析与解读：通过比对样本DNA序列和基因组参考序列，分析和解读DNA中的突变信息。

结合人类基因组数据库和相关研究文献，可以判断突变的功能影响和相关疾病风险。

二、基因突变检测的应用基因突变检测在医学领域有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 遗传病的诊断：基因突变是遗传病的主要原因之一，通过对患者基因组的检测，可以准确地判断突变与遗传病的关系。

这对于许多遗传性疾病的确诊和早期干预具有重要意义。

2. 肿瘤早期诊断：基因突变在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。

通过检测肿瘤相关基因的突变，可以提前发现潜在的肿瘤风险，从而实现早期诊断和治疗。

3. 个性化治疗方案设计：不同基因突变可能导致药物反应性的差异。

通过对患者基因组的检测，可以为个性化治疗方案的设计提供重要依据，以增加治疗的有效性和安全性。

4. 非侵入性产前基因检测：基因突变检测技术的发展，使得非侵入性产前基因检测成为可能。

通过检测孕妇血液中胎儿的基因突变情况，可以预测某些遗传性疾病的风险，对胎儿的健康进行评估和干预。

药物遗传毒性研究技术指导原则药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。

拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。

遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。

以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA 损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。

染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。

在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。

由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。

但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。

此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。

因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。

二、基本原则（一）实验管理药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。

（二）具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。

应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并试验结果进行全面的分析与评价。

两种人类淋巴母细胞TK、HPRT基因突变实验比较研究张勇;张立实【摘要】背景与目的:比较2种人类淋巴细胞在4种受试物作用下TK、HPRT 2个位点突变情况,为其在遗传毒性实验中的应用积累资料.材料与方法:甲磺酸乙酯(ethl methanesulfonate,EMS),甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS),乙二醛(glyoxal,GLY),邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)4种不同化学结构和致突变方式的致突变物作为受试物,采用微孔培养板法比较TK6和TK6-E6细胞在TK和HPRT 2个位点的突变情况.结果:TK6-E6细胞比TK6细胞对4种受试物毒性更为耐受;4种受试物在2种细胞,2个位点突变实验结果均为阳性,以TK6-E6细胞的TK 实验最为敏感;TK6的慢生长集落比例(RSC)较TK6-E6低,各受试物间无差别(P＞0.05).结论:TK6-E6和TK6细胞在TK、HPRT 2个位点的基因突变实验中均能检出致突变物;TK6-E6相对于TK6对细胞毒性耐受,可以用于检测更高浓度的受试物,同时有较高的突变敏感性.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2007(019)001【总页数】4页(P36-39)【关键词】人类淋巴母细胞;基因突变实验;甲磺酸乙酯;甲磺酸甲酯;乙二醛;邻苯二胺【作者】张勇;张立实【作者单位】重庆医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,重庆,400016;四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生教研室,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R3TK6，TK6-E6细胞是人类淋巴母细胞，来源于同一亲本WI-L2［1］，但p53状态不一样。

TK6细胞p53为野生型，而TK6-E6细胞转染了HPV16病毒，病毒蛋白E6和P53蛋白结合使其很快降解，是p53功能缺失型。

2种细胞TK基因均为杂合型（TK+/-），可以方便地测定TK，HPRT突变情况，用于检测和评价受试物的遗传毒性。

体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。

TK基因突变属于常染色体基因突变。

TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。

在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。

但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。

若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。

根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。

在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。

染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

TK基因突变试验导则1 范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。

基因突变检测的方法原理
基因突变检测的方法原理可以根据具体的技术和方法而有所不同，以下是几种常见的原理：
1. Sanger测序：这是一种经典的基因突变检测方法，利用DNA聚合酶合成新的DNA链时，加入由目标基因特定区域的引物引导的特殊标记碱基。

在扩增过程中，当遇到突变位点时，会阻碍DNA链的延伸，从而导致新合成的DNA链长度发生变化。

通过电泳分析，可以根据DNA片段的长度差异来确定突变位点。

2. PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）：这种方法通过利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的特定区域，然后使用特定的限制性内切酶来切割扩增产物。

由于突变位点可能会影响限制性内切酶的切割位点，因此突变会导致产物长度的变化。

通过电泳分析，可以根据DNA片段的长度差异来确定突变位点。

3. 基因芯片（Microarray）：这种方法利用基因芯片上固定的DNA探针，通过杂交反应来检测目标基因的突变。

基因芯片上包含了大量的DNA探针，每个探针对应一个特定的基因序列。

当目标基因中存在突变时，杂交反应的信号强度会发生变化，从而可以确定突变位点。

4. 下一代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）：这种高通量测序技术可以同时对大量的DNA序列进行测序。

通过将目标基因的DNA样本分解成许多小片段，并使用特定的引物扩增这些片段，然后进行测序。

通过比较测序结果
与参考序列的异同，可以确定是否存在基因突变。

这些方法仅是基因突变检测的一部分，具体的方法选择取决于需要检测的基因、突变类型以及实验室的设备和技术能力。