顶头孢霉的原生质体转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

160生物技术世界 BIOTECHWORLD1 顶头孢霉菌及其原生质体简介顶头孢霉菌是典型的丝状真菌,在育种方面适合采用原生质体融合技术。

本文采用蜗牛酶处理相关菌丝体来制备原生质体,探讨蜗牛酶的浓度以及菌龄对分离原生质体数量的影响。

2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株顶头孢霉菌:来自华北制药河北华民药业(发酵液筛选出菌株)2.1.2 培养基及稳定剂菌丝生长液体培养基:葡萄糖5g,蔗糖35g,玉米浆31g,(NH4)2SO4 8g,豆油5mL;灭菌前pH6.8-7.2,121℃灭菌20min。

渗透压稳定剂:0.7mol/l NaCl 2.1.3 试剂蜗牛酶:上海励瑞生物科技有限公司2.2 试验方法2.2.1 顶头孢霉菌菌丝体的培养将顶头孢霉菌菌株接种在新配制的菌丝生长液体培养基中,28℃,220r.min-1恒温摇床分别培养42h、48h、54h、60h、66h。

2.2.2 顶头孢霉菌原生质体制备将培养好的顶头孢霉菌在12000r/min下离心5min,收集菌丝,将沉淀用0.7mol/L Nacl洗涤两次;将洗涤完后5个培养时间的顶头孢霉菌分别分装于5个小离心管中,每管60mg新鲜菌丝体,向这些离心管中分别加入0.6mL浓度为1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL的蜗牛酶,33℃振荡培养3.5h;用G2漏斗滤去未酶解的菌丝;滤过液4000r/min离心10min,收集原生质体;所得沉淀用0.7mol/L的Nacl洗涤离心三次,用等量的0.7mol/L的Nacl悬浮原生质体,保持渗透压的稳定;同时在微镜下观察原生质体的形态并计数。

3 结果3.1 不同浓度蜗牛酶对制备原生质体的影响不同浓度蜗牛酶酶解条件下得到的原生质体如图1。

由表1和图1可见,随着蜗牛酶浓度的升高,酶解出的原生质体数一直升高,当浓度为3mg/mL时,数量最大,提高酶的浓度,原生质体量增加不显著。

因此,5mg/mL的蜗牛酶的效果最好。

2020届微生物学期末考试经典题目题库整理1指出下列培养基各成分的作用，并指出是用来培养哪种类型的微生答案：该培养基中，甘露醇是碳源和能源物质，KH2PO、Mg2SO4 • 7H2O、NaCl、CaSO4 • 2H2O主要提供无机盐离子，CaCO3主要用于调节微生物培养过程中培养基pH值的降低，这一培养基用来培养化能异养微生物。

2、举例说明霉菌与工农业生产、医药实践、环境保护等方面的密切关系。

答案：霉菌对工农业生产、医疗实践、环境保护等有着密切的关系，例如，工业上的大量发酵产物都是通过霉菌来实现的，柠檬酸、葡萄糖酸等有机酸；淀粉酶、蛋白酶等酶制剂；青霉素、头孢霉素、灰黄霉素等抗生素；核黄素等维生素。

利用梨头霉等对甾体化合物的生物转化以生产甾体激素类似药物；以及利用霉菌在生物防治、污水处理和生物测定等方面的应用等。

在食品制造方面，霉菌可以进行酱油的酿造和干酪的制造等。

在基础理论研究方面，霉菌是良好的实验材料，如Neurospora crassa(粗糙脉孢霉)和Aspergillus nidulans(构巢曲霉)是微生物遗传研究中的常用实验材料。

大量真菌可引起工农业霉变，如食品、纺织品、皮革、木材、纸张等。

也是植物最主要的病原菌，却马铃薯晚疫病、稻瘟病和小麦锈病等。

少量的霉菌也可引起动物和人体传染病，如皮肤藓症等。

3、什么是烈性噬菌体？简述其裂解性生活史。

答案：凡是在短时间内能连续完成吸附→侵入→增殖→成熟(装配)→裂解(释放)这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称之为烈性噬菌体。

裂解性生活史①吸附当噬菌体与其相应的特异宿主在水环境中发生偶尔碰撞后，如果尾丝尖端与宿主细胞表面特异性受体接触就可以触发须把卷紧的尾丝散开，随即就附着在受体上，从而把刺突、基板固着于细胞表面。

①侵入吸附后尾丝收缩，基板从尾丝中获得一个构象刺激，使尾鞘中的144个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩成原长的一半，由此把尾丝推出并插入细胞壁和膜中。

tosine M ethylation within a P opulation of Newly Resynthesized Brassica napus Allopolyploids[J ].P lant Physiol ,2006,140(1):336-348.[24]M adlung A ,M asuelli R ,W ats on B ,et al.Rem odeling of DNA methyla 2tion and phenotypic and transcriptional changes in synthetic Arabidopsis allotet 2raploids [J ].P lant Physiol ,2002,129(2):733-746.[25]Salm on A ,Ainouche M L ,W endel J F.G enetic and epigenetic conse 2quences of recent hybridization and polyploidy in Spartina (P oaceae )[J ].Mol .E col .,2005,14(4):1163-1175.食用菌原生质体技术的研究进展鹿桂花,陈恒雷,吕杰,曾宪贤,张军3(新疆大学离子束生物工程中心,新疆乌鲁木齐830008)摘要:综述了食用菌原生质体再生、诱变、融合技术以及原生质体技术与其他生物技术相结合的研究进展,提出了在现有研究中存在的问题,并展望了原生质体技术的发展趋势。

关键词:食用菌;原生质体;诱变;融合中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)01-0087-03R evie w on the Technology of Protoplast from Edible FungusLU G ui -hua ,CHE N Heng -lei ,LV Jie ,ZE NG X ian -xian ,ZH ANGJun3(I on Beam Bio -engineering Center ,X injiang University ,Urumqi 830008,China )Abstract :Protoplast technique ,method of mutation ,protoplast fusion technique and the combining of protoplast technique and other biology tech 2niques were reviewed in this paper ,the deficiencies and the tendency of the research on protoplast technique was als o generalized as well.K ey w ords :edible fungus ;protoplast ;mutation ;protoplast fusion收稿日期:2007-09-02;修回日期:2007-11-12基金项目:国家发改委高技术产业化示范工程项目资助([2004]2077)作者简介:鹿桂花(1982-),女,硕士生,从事离子束生物工程与食用菌发酵及多糖研究;3通讯作者(C orresponding author ):张军(1962-),男,博士,教授,E -mail :zhj @ 。

实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：放线菌与真菌形态结构观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年10月16日一、实验目的和要求1.学习并掌握放线菌(链霉菌)，真菌(酵母、霉菌)形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。

2.熟练掌握显微镜的使用。

二、实验内容和原理1.放线菌放线菌，是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。

因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。

大多数有发达的分枝菌丝。

菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。

可分为：营养菌丝，又称基内菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。

2.真菌[1]酵母菌：为单细胞真核生物。

呈圆形、卵形、椭圆形或柠檬型。

各体直径比细菌大几倍到几十倍。

菌落大而厚，湿润光华，颜色多为乳白色、灰白色、似细菌落。

繁殖方式包含无性繁殖(芽殖或裂殖)与有性繁殖(形成子囊与子囊孢子)。

[2]酵母菌的出芽生殖：在细胞的一端初生小突起，如芽状，逐渐增大。

细胞核一分为二，其中一个进入小突起，经细胞壁缢缩。

芽体与母细胞脱离，形成新个体。

若芽体不脱离母体而有继续生出新芽，而芽细胞聚集形成芽簇，芽簇细胞伸长呈丝状或藕节状，称做假菌丝。

[3]美兰染色法：美兰是一种无毒性染料，氧化型呈蓝色，还原型呈无色。

活细胞具有较强还原能力，使美兰由蓝色变成无色。

染色后，酵母活细胞无色，死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色。

[4]酵母菌肝糖粒碘液染色：肝糖粒是酵母细胞的内含物，属于碳源及能源性贮藏物。

用碘液染色，菌体呈淡黄色，肝糖粒呈红褐色。

[5]霉菌：由菌丝体构成，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝。

由繁殖菌丝产生孢子。

菌丝和孢子的宽度比细菌和放线菌大几倍到几十倍。

制片时滴加乳酚油，防止干燥，可保持菌丝体原形。

霉菌生长发育和代谢途径的分子机制霉菌是一类具有多样化代谢途径的真核生物，它们可以在许多环境中生长繁殖并产生大量的有用化合物。

霉菌的代谢途径非常复杂，包括碳代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、二次代谢等多个途径。

这些代谢途径对于霉菌的生长发育和产生次生代谢产物都发挥着重要作用。

本文将讨论霉菌代谢途径的分子机制，并深入探讨霉菌生长发育的分子机制。

1. 霉菌生长发育的分子机制霉菌的生长发育主要涉及到四个方面，包括细胞极性、细胞分裂、营养吸收以及激素信号传导。

细胞极性是指细胞形态的建立与维持，霉菌细胞的极性化主要是通过Cdc42 GTPase等蛋白质的参与实现的。

Cdc42 GTPase可以与效应蛋白For3等结合，调控细胞极性形成。

细胞分裂是指霉菌细胞的复制与分裂，细胞分裂依赖于多种酶的调节，如Myc1和Sid2等蛋白质参与。

营养吸收则是细胞生长所必需的过程，霉菌通过分泌水解酶等，使营养物质转化为可以被吸收的形式。

激素信号传导则是到细胞内外环境变化的感应与反应过程，通过荧光共振能量转移（FRET）等技术可以发现许多激素信号传导的通路，如cAMP/PKA，Ca2+/CaM等通路参与了霉菌的生长发育。

2. 碳代谢的分子机制碳代谢是生物体代谢中最为基础的途径，霉菌通过吸收，转化和利用碳源来完成生长发育和代谢活动。

霉菌碳代谢的分子机制可以分为三个方面：糖解途径，三羧酸循环和戊糖磷酸途径。

糖解途径是将简单糖分子分解为能够产生ATP的代谢产物，霉菌通过糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸，乳酸和乙醇等代谢产物。

三羧酸循环包括多种酶的参与，霉菌可以通过环化反应和脱羧反应使代谢产物进入三羧酸循环。

戊糖磷酸途径是一个非氧化的途径，与三羧酸循环相关，该途径将糖类分解为核苷酸和三磷酸鸟苷等代谢产物，同时也可以提供有机酸和碳源。

3. 有机酸代谢的分子机制有机酸代谢反应种类繁多，包括丙酮酸代谢、丁酸代谢、琥珀酸代谢与柠檬酸循环等。

丙酮酸代谢是通过烯醇醇酸变换、脱氧酸变换等反应将丙酮酸产物转化为琥珀酸，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPCK）是决定反应速率的关键酶。

食用菌基础霉菌丝状真菌—霉菌编者按：食用菌栽培中常见的污染是霉菌，为了方便网友了解霉菌相关基础知识，我们特转载华南师范大学的此篇文章。

霉菌(mould,mold)属于丝状真菌(filamentous fungi)。

凡在营养基质上形成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网形丝状菌体的真菌，统称为霉菌。

霉菌包括分类学上许多不同纲或类的真菌，它们分别属于藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。

霉菌在自然界分布极为广泛。

它们存在于土壤、空气、水体和生物体内外等处，与人类关系极为密切。

①工业应用：柠檬酸、葡萄糖酸等多种有机酸，淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等多种酶制剂，青霉素和头孢霉素等抗生素，核黄素等维生素，麦角碱等生物碱，真菌多糖和植物生长刺激素(赤霉素)等产品的生产；利用某些霉菌对甾族化合物的生物转化生产甾体激素类药物；②食品酿造：酿酒、制酱及酱油等；③基础理论研究：如对粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的研究为生化遗传学建立提供了大量资料；④危害：霉菌能引起粮食、水果、蔬菜等农副产品及各种工业原料、产品、电器和光学设备的发霉或变质，也能引起植物和动物疾病。

如马铃薯晚疫病、小麦锈病、稻瘟病和皮肤癣症等。

一、霉菌的形态与构造1.菌丝霉菌的营养体由菌丝构成。

菌丝可无限伸长和产生分枝，分枝的菌丝相互交错在一起，形成了菌丝体。

霉菌的菌丝有两类：一类菌丝中无横隔，整个菌丝体就是一个单细胞，含有多个细胞核。

藻状菌纲中的毛霉、根霉、犁头霉等的菌丝属于此种形式(图1A)。

另一类菌丝有横隔，每一段就是一个细胞，整个菌丝体是由多个细胞构成，横隔中央留有极细的小孔，使细胞质和养料互相沟通。

子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类的菌丝皆有横隔(图1B)。

霉菌菌丝直径一般为3～10μm，与酵母细胞类似，但比细菌或放线菌的细胞约粗10倍。

图1 霉菌的营养菌丝A.一条菌隔菌丝的一部分；B.有隔菌丝的一部分。

图2 粗糙脉胞菌的菌丝分化及其细胞壁的成分霉菌丝状细胞的构造与酵母菌细胞十分相似。