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食用菌原生质体融合育种技术简介原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein 在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态，变成了圆球体，但它仍然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单位。
食用菌原生质体融合（protoplastfusion）是指通脱壁后的不同遗传类型的食用菌菌株原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或者整套基因组（核基因、线粒体基、胞质基因）的交换和重组，生产出新的食用菌品种和类型，也就是说，食用菌原生质体融合育种技术上是一种不通过有性生活史（sexualcycle）而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。
近日，在佛山科技学院召开的“草菇原生质体融合育种研究”成果鉴定会上获悉，该院农学系利用现代生物工程原生质体融合育种技术，成功地选育出草菇新品种Ｖｐ—２、Ｖｐ—３。
专家们实地考察后认为，该研究成果数据可靠，技术新颖，品种表现良好，种性稳定，菌丝生长健壮，爬料速度快，抗杂能力强，子实体结实，基部紧凑，个体适中，兼备双亲优良性状，生物特性明显优于目前生产使用的当家品种。
鉴定专家一致认为，该研究成果居于国内领先水平。
据项目鉴定委员会主任、省微生物研究所研究员丘元盛介绍，该项目成果具有技术的前瞻性和研究的独创性：采用超声波处理结合溶壁酶酶解，很好地解决了草菇细胞壁裂解的难题，为原生质体融合育种提供了大量原生质体，完善了草菇原生质体制备和融合技术；创造性地利用不同草菇品种间存在拮抗作用进行融合子初筛，利用不同草菇种间分解脱脂牛奶、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸等物质的能力差异性，定量检测融合子与亲本间的酶分解能力，通过ＤＮＡ随机多态性差异检测进而确定融合子，技术操作新颖，为食用菌育种开辟新途径；开创性采用液氮研磨与溶壁酶酶解相结合提取草菇菌丝ＤＮＡ技术，获得高纯度遗传物质，圆满解决草菇等真菌ＤＮＡ提取过程中破壁困难和纯度不高等技术难题，实现现代分子生物学水平格测融合子的技术性飞跃。
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
微生物原生质体融合育种技术及其应用摘要：工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。
微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。
结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。
关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组引言：微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。
自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。
原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。
与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。
1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。
接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。
本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。
1 资料和方法：1.1 资料来源由第一作者在CNKI进行检索。
网址：/。
英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。
英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。
1.2 入选标准纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。
②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。
排除标准：①与此文目的无关。
②较陈旧的文献。
③重复同类研究。
1.3 质量评估原生质体融合技术的论文56篇，综述性29篇，研究应用型27篇（其中工业应用型20篇）。
2 结果：2.1 纳入文献基本情况初检得到56篇文献，中文50篇，英文6篇。
阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与此文无关36篇，内容重复性的研究10篇，共保存10篇文献做进一步分析。
选取最具代表性的6篇文章进行具体分析。
第1篇是对原生质体融合技术及其应用的综述性文章，第2篇研究了影响原生质体融合的因素。
第3—6篇是关于原生质体在微生物工程中具体应用的文章，其中第6篇是原生质体融合技术与分子克隆技术相结合的方法，体现了原生质体发展的新方向。
2.2 结果描述2.2.1 原生质体融合技术原生质体融合技术一般分成五大步骤:直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定。
2.2.1.1 原生质体的制备和再生原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。
在放线菌和细菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。
2.2.1.2 原生质体的融合由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。
在微生物原生质体融合中,诱导融合方法主要有化学法(一般采用PEG结合高Ca2+、pH诱导法)、物理法(包括电融合和激光诱导融合法等)。
2.2.1.3 融合子的筛选利用营养缺陷型标记筛选融合子：融合双亲为不同的营养缺陷型,原生质体融合后于基本培养基进行培养。
由于双亲都丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能生长,而在融合子中,缺陷的遗传物质得到互补,所以可在基本培养基上长出菌落,利用这种方法即可检出融合子。
利用抗药性标记筛选融合子：微生物的抗药性是由遗传物质决定的,不同种微生物对同种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行筛选。
利用灭活标记筛选融合子：通过灭活标记筛选融合子是指将单亲或双亲的原生质体经紫外线照射、加热或经过某些化学药剂处理,使其丧失在再生培养基上再生的能力,两亲株融合后,融合子损伤互补,因而可在再生培养基上存活。
利用荧光染色标记筛选融合子：在制备原生质体时,向酶解液中加入不同荧光色素,使双亲原生质体在特定波长下呈现不同颜色,原生质体融合后,直接选出带有两色荧光的融合子即可。
利用某些特殊的生理特征作为标记筛选融合子：利用亲本对营养物质利用及固氮能力方面的差异来筛选融合子。
利用生化测定指标选择融合子：通常测定的生化项目有DNA含量、氨基酸量、酸性磷酸酶、同工酶和电泳等。
DNA含量的测定有两种方法:一是提取DNA 后,以紫外分光光度计测定其含量;二是直接以显微分光光度计测定孢子或菌丝的DNA含量,一般来说,融合子的DNA含量高于任何一个亲本的博莱霉素(IJK)含量,但却少于双亲DNA含量之和。
一般情况下,比较融合子与双亲氨基酸含量百分比,电泳测定亲本和融合子酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶谱,两者的酶谱存在着一定的差异。
常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法。
2.2.2 影响原生质体融合技术的因素2.2.2.1 影响原生质体制备的因素培养基成分对原生质体制备的影响：用酶分解微生物细胞壁,首先要培养菌体或菌丝体。
菌体生长的培养基对原生质体化有明显影响,并且这种影响视微生物而异。
原生质体化前在培养基中加入某些物质阻止细胞壁的合成,可以提高酶解的效果。
培养方式对原生质体制备的影响：不同菌种或同一菌种用同一的培养方法原生质体化效果可能不一样,丝状真菌常用平板玻璃纸法,细菌和酵母菌多用液体震荡培养。
菌龄对原生质体制备的影响:微生物生理状态是原生质体化的重要影响因素之一。
菌龄过长,菌丝细胞壁老化增厚,不易于释放原生质体;过短则菌丝体容易破裂,释放原生质体数量较少。
一般年轻菌丝和顶端菌丝有利于原生质体的制备和再生。
菌体浓度对原生质体制备的影:酶解时一般先将菌液离心收集菌丝体,然后加入一定量的酶液。
适合的菌体密度可让细胞与酶充分接触反应,提高酶解效果。
菌丝体密度一般以3ml酶液中加入300 mg新鲜菌丝体为宜。
酶系和酶浓度对原生质体制备的影响:利用酶分解细胞壁,由于各菌种细胞壁的成分和结构存在差异,因此不同的菌株所用酶的种类和浓度都有很大差异。
酶的种类、浓度是制备原生质体最关键的因素。
细菌一般采用溶菌酶去壁,浓度为0.02~0.5 mg/ml。
酶解时间对原生质体制备的影响：酶解时间的长短直接影响原生质体化的效果,处理时间过短,脱壁不完全;处理时间过长,会导致原生质体脱水皱缩,再生率显著降低。
时间从20min~10 h不等。
温度对原生质体制备的影响：不同的酶均有各自的最适酶解温度。
酶解时温度选择的原则是既有利于原生质体化,又能防止原生质体被破坏。
细菌的最适酶解温度一般为35~37e或42e,真菌的最适酶解温度为30~35e,放线菌的最适酶解温度为28~37e。
pH值对原生质体制备的影响：酶解时的pH值随酶和菌种有一定的差异,需根据实际情况对pH值进行优化。
pH6.0对菌种S-37原生质体制备有利。
缓冲液和稳定剂对原生质体制备的影响：细胞壁脱去后,原生质体必须在高渗环境中保存及生长,否则会因为渗透压而破裂。
稳定剂类型和渗透压也是原生质体制备的重要因素。
选用合适的稳定剂不仅能获得较高的原生质体制备率,而且得到的原生质体大小较均匀。
常用的缓冲液有磷酸缓冲体系和柠檬酸缓冲体系。
渗透压稳定剂分为两类:一类是盐溶液系统,包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2,浓度为0.3~1.0 mol/L;一类是糖溶液系统,包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖、纤维二糖、鼠李糖等,浓度为0.3~0.6 mol/L。
一般认为易于渗入细胞膜或易被分解的物质不宜作稳定剂。
酶解方式对原生质体制备的影响：制备原生质体时轻轻摇动或敲击管壁可让酶与菌体混合更均匀,并保持良好的通气条件,有利于提高原生质体率。
有人曾对比了用试管、锥形瓶和培养皿等容器制备原生质体的效果,结果使用培养皿时原生质体分离效果最好,原生质体制备率高于试管或锥形瓶3~5倍。
2.2.2.2 影响原生质体融合的因素融合剂PEG对原生质体融合的影响：仅将原生质体混合在一起融合频率并不高,需要添加PEG(聚乙二醇)提高融合率。
PEG的相对分子量和浓度高低对融合都有较大影响。
PEG的浓度一般为30%~50%,浓度过高会导致原生质体皱缩甚至中毒,过低导致原生质体破裂。
PEG的相对分子量从1 000~6 000不等,因菌种不同而定。
融合时间和温度对原生质体融合的影响：PEG处理时间是融合的最关键因素之一,尤其是对高Ca2+和高pH值溶液处理时,时间长短非常重要。
PEG溶液加入后,原生质体间即强烈地发生黏着,融合能长时间有效进行,因此PEG处理的时间常很短。
融合处理时间1~60 min,大多数情况下为1~10 min。
由于PEG有一定的毒性,处理时间过长,会导致原生质体失活。
温度对原生质体融合也有一定的影响。
细胞膜在较高温度下流动性增加, PEG黏度下降,有利于原生质体的融合。
融合菌株间的亲和力对原生质体融合的影响：到目前为止,并不是所有的菌种间都能利用原生质体融合技术进行融合,其中很大一部分原因是亲本菌株间的亲源关系造成的。
虽然原生质体融合技术能够跨越种、属的界限,但某些远源关系的菌株融合后融合子重组染色体不稳定,容易发生分离现象。
另外,原生质体的活性不高也会导致融合率低下。
无机离子对原生质体融合的影响:原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合,而K+、Na+会显著降低融合率,融合时一般Ca2+0.01 mol/L、Mg2+0.02 mol/L为佳。
各菌种间略有差异。
2.2.2.3 培养基对原生质体再生的影响再生培养基的组成对原生质体的再生影响相当明显,培养基中碳源会影响微生物原生质体的再生率。
在菌体生长培养基中添加适量的某些营养因子可有效提高再生率,常用的有酵母膏、蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。
稳定剂对原生质体再生的影响:稳定剂的种类和渗透压的大小是原生质体保持形状不破裂的关键因素,也是原生质体再生中的重要影响因素。
一般情况下,再生培养基中的最适稳定剂和最佳渗透压与酶解时类似,可以参照酶解时的条件进行。
酶解浓度和时间对原生质体再生的影响:酶解浓度和时间不仅仅影响原生质体制备,而且还会影响到原生质体再生。
