植物种质资源在苗圃中保存易受病虫害的侵袭和恶 劣环境的威胁 ,果树的大田保存尤其受其影响巨大 ,组织 培养保存因长期离体培养需多次继代 ,不可避免地引起一 些遗传性状的改变 ,超低温保存是植物种质保存的理想途 径 ;自从 l 973年 N ag和 S treet首次成功地用液氮超低温保 存了胡萝卜悬浮细胞后 [1 ] ,迄今进行超低温保存的植物材 料已达两百余种 ,两步法和预冻法等多种超低温保存技术 也逐步发展起来 ,但这些传统的超低温保存方法操作繁琐 耗时 ,并且需要程序降温仪等设备 ,所以对这些方法的普 遍推广使用还存在不少困难 [2 ] ;近年来 ,发展较快的玻璃 化冻存法克服了这些困难 ,该法具有设备简单、程序简化 和冻存效果好等优点 ,并在保存器官和组织水平的结构完 整性方面有独到之处 [ 3] 。近几年来 ,国外用玻璃化超低温 保存法成功保存的园艺作物品种有樱桃、甜樱桃 、梨 、苹 果 [4,5 ]等几十余种 ,尤其利用玻璃化法已成功保存了几十 种植物的茎尖和愈伤组织 ,本文拟就近年国内在番木瓜 、 柿、苹果 ,以及欧柑等果树种质资源的玻璃化保存法来对 其进行一定的初探。
2 结果与分析
211 低温锻炼对存活率的影响 将培养于含有高浓度糖 溶液 ( 5% )和 ABA ( 0. 5m g·L ) 的逆境培养基中生长 60d 的无菌苗分别转入 0—7℃下 ,培养 1—6周 。实验结果可 以看出 ,随着低温锻炼时间延长 ,存活率增加 ,但 4周之后 存活率基本保持不变 。不同的低温处理中 , 4℃处理得到
M S + 6—BA 015 mg / I上 。然后我们用其愈伤组织作为 离体培养的材料。 112 方 法 玻璃化冻存一般包括预培养 、玻璃化保 护液脱水 、冷冻保存、化冻洗涤和再培养 5个主要环节 [6 ] 。 11211 预培养 对通过继代培养所获得的植物的茎尖或 愈伤组织进行组织培养。当然在预培养前要对试管里的 植株进行预处理 ,即低温锻炼 ,通常是将继代生长 60d的 试管苗分别置于 0—4℃、黑暗的培养箱中低温锻炼 1—6 周 ,进行不同的比较。 11212 玻璃化保护剂处理 将预培养后经过以上处理后 的茎尖或愈伤组织 ,再用 PV S [ 30% 甘油 ( Gly) , 15%乙二 醇 ( EG) , 15%二甲基亚砜 (DM SO ) , 014 m ol/L 的蔗糖 ]于 0℃下处理不同时间 ,移去原液 ,换 1次新鲜的 PVS 溶液 , 然后将冷冻管装在金属套上 ,套上一根细线 ,每个金属套 上套两个管 ,然后 将材料 迅速投入 到液氮 中。预培 养、 60% PVS 溶液 预处 理和 PVS 溶 液处 理均 进行 单 因子 试验。 11213 解冻处理和再培养 保存 24 h后 ,从液氮中取出 冷冻管 ,在 40℃下迅速化冻 ,待冷冻管内冰化尽以后 ,用 112 mol /L 的蔗糖 + M S 基本培 养基洗 涤两次 ,每 次 10 m in。再转到继代培养基上 ,先进行暗培养一周 ,然后转移 到光下 ,以与对照相同的条件进行再培养 。一周统计成活 率 (茎尖颜色恢复为绿色 ,有部分长芽或长愈伤组织的茎 尖占全部试验茎尖数的百分率 ) ,转变为绿色的计为成活 , 否则计为死亡 ,一个月统计植株的再生率 (直接再生成芽 或生长成愈伤组织的茎尖占全部试验茎尖数的百分率 ) 。 最后将再生的植株转入到生根培养基上进行生根培养 ,生 根后移入到温室内 。
