在毕赤酵母中表达的重组疟疾疫苗(PfCP-2.9)的纯化研究

专利名称：在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法专利类型：发明专利
发明人：李巨浪,伊芬娜,刘璨颖
申请号：CN201710452655.6
申请日：20170615
公开号：CN107365374A
公开日：
20171121
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，其包括如下步骤：(1)构建重组猪EGF表达载体；(2)用重组质粒pJ912‑pEGF电转化毕赤酵母X‑33；(3)生物发酵表达猪EGF。

本发明的方法能够在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子。

申请人：佛山科学技术学院
地址：528000 广东省佛山市禅城区张槎街道江湾一路18号
国籍：CN
代理机构：广州新诺专利商标事务所有限公司
代理人：许英伟
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BMP4重组蛋白在毕赤酵母中表达载体构建与纯化分析
赵卓;籍昊天;肖业臣
【期刊名称】《东北师大学报:自然科学版》
【年(卷),期】2022(54)1
【摘要】以骨形态发生蛋白(BMP4)为研究对象,将BMP4基因与IgG-Fc基因结合,改造成为BMP4-Fc融合蛋白,经巴斯德毕赤酵母诱导表达和DEAE阴离子纯化获得目的蛋白,并利用间充质干细胞验证了其生理活性.结果表明:使用巴斯德毕赤酵母能够很好表达BMP4-Fc融合蛋白,通过提纯条件,成功分离纯化BMP4-Fc融合蛋白,其生理活性达到商业化纯品水平,为BMP4生产与开发提供了新路径.
【总页数】6页(P113-118)
【作者】赵卓;籍昊天;肖业臣
【作者单位】吉林师范大学生命科学学院;吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学系
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
【相关文献】
1.重组hIL-2表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达
2.rhKD／APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化
3.重组人神经生长因子真核表达载体构建及其在毕赤酵母中的表达与纯化
4.重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达
5.重组小鼠凝血因子Ⅶ-pPIC9K表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达
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人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化蒙翠凤;饶晓璐;郑成已;王世媛;陈清西【摘要】ω干扰素(IFN-ω)是同IFN-α功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子,它具有同IFN-α、IFN-γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用.采用5L 发酵罐发酵表达IFN-ω,发酵培养液经超滤膜浓缩、SP层析柱梯度分离,得到糖基化的IFN-ω,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-TOF MS)和N 端蛋白序列分析仪分析其分子质量和N端序列,用细胞病变抑制法测定活性.结果表明,诱导约48 h时,目的蛋白表达量最高,通过SP梯度洗脱,可将糖基化和非糖基化的IFN-ω分离,质谱分析糖基化蛋白样品,质谱峰为糖基化蛋白特有的峰.纯化后糖基化的IFN-ω抗病毒活性为1.46× 108 U/mL.%IFN-w is a kind of interferon molecules, which has similar function but different antigenicity to IFN-a. It can inhibit virus replication like IFN-a, IFN-y and tumor necrosis factor alpha. 5 L fermenter was used to ferment and interference was expressed. Then,the glycosylated interferon a> was purified by a procedure stepped by ultrafiltration and gradient elution SP chromatography column. Its molecular weight and N amino acid sequence were analyzed by MALDI TOF-TOF MS and the N protein sequence analyzer, respectively. In addition,IFN-a) activity was determined by cell changes suppression method. The results showed that IFN-w expression level reached to highest in induced 48 h. The glycosylated and unglycosylated IFN-co could be separated by SP gradient elution completely. The glycosylated IFN-w showed a series of continuous peaks by mass spectrometry,which is thecharacteristic peak of glycosyl protein. The antiviral activity of the purified glycosylated IFN-w was 1. 46X108 U/mL【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)006【总页数】5页(P1074-1078)【关键词】IFN-ω;表达;纯化;N端测序;活性测定【作者】蒙翠凤;饶晓璐;郑成已;王世媛;陈清西【作者单位】厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】TQ929+.1干扰素（IFN）是一族由多种细胞产生的，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白［1］.根据产生细胞、受体和活性等综合因素可将IFN分为2种类型：Ⅰ型IFN又称为抗病毒IFN，生物活性以抗病毒为主，有3种分子形式：IFN－α、IFN－β和IFN－ω；Ⅱ型IFN 又称免疫IFN［2］，主要是指IFN－γ.IFN－α、IFN－β和IFN－ω的受体为同一种分子，表达在几乎所有类型的有核细胞表面，因此这些IFN的作用范围十分广泛［3］.IFN－ω是同IFN－α功能相近但抗原性不同的一类IFN分子，它具有同IFN－α、IFN－γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用［4］，目前，IFN－α已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤的治疗，效果显著，而有关IFN－ω的研究报道则较少［5］，有研究表明IFN－ω有比IFN－α更强的抗病毒活性［6］.由于IFN－ω具有较强的抗病毒复制、抗细胞增殖和免疫调节等生物活性，而且IFN－ω 与IFN －α、IFN－β、IFN－γ 的抗原特性不同［7］，不会与IFN－α、IFN－β、IFN－γ 的抗血清或单克隆抗体发生交叉反应［8］，因此，该细胞因子有望用于治疗多种肿瘤、病毒性疾病以及对IFN－α、IFN－β或IFN－γ耐药的患者［9－10］.目前，国外已有采用多种表达系统制备IFN－ω的报道，其中既有大肠杆菌（Escherichia coli）原核表达系统，也有酵母细胞真核表达系统，均表达出具有生物活性的IFN－ω，而国内关于IFN－ω的报道和研究仍很少［11］.齐连权等在毕赤酵母中分泌表达IFN－ω，但表达量较低，只有10mg／L左右［12］.糖基化是真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，具有重要的生物学意义，糖蛋白的糖链能修饰并改变蛋白的内在特性，在决定蛋白质的多种生物学功能并且能保护蛋白质免受热力学降解方面发挥重要作用［13］.因此，本文构建了IFN－ω 毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，筛选得到了较高表达量的转化子，表达约为80mg／L，经层析柱纯化，获得糖基化的IFN－ω，并对糖基化的IFN－ω进行质谱分析、N端测序及对其活性进行了初步的检测.1 材料和方法1.1 材料毕赤酵母工程菌 GS115（IFN－ωPAo815sm），由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白胨为英国Oxoid公司产品；丙烯酰胺为Promega公司产品；SP Sepharose Fast Flow 填料为 GE Healthcare公司产品；IFN－ω标准品为Ebioscience公司产品；人羊膜细胞（WISH）为美国ATCC公司产品；水泡性口炎（VSV）病毒为美国ATCC公司产品；其他试剂均为国产分析纯.主要仪器：5L全自动发酵罐，德国B.Braun Biotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，Beckman公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic 100蛋白纯化仪，GE Healthcare公司；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI TOF－TOF MS），Bruker公司；N 端蛋白序列分析仪（PPSQ－31），日本岛津公司；M2e酶标仪，MD公司.1.2 方法1.2.1 IFN－ω的发酵表达发酵条件参考文献［14］，将保藏菌株划线于酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（1%（质量分数，下同）酵母粉，2%（质量分数，下同）蛋白胨，1%（质量分数，下同）葡萄糖，1.8%（质量分数，下同）琼脂糖）上，28～30℃ 生化培养箱培养 36h，得 GS115（IFN－ω PAo815sm）单菌落.从YPD琼脂培养基上挑单菌落，接入1L三角瓶装的300mLYPD液体培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，1%葡萄糖）中，于200r／min 28～30℃摇床培养18h.按体积分数为10%的接种量接种，即接300mL摇瓶种子到含3 000mL酵母膏胨甘油（BMGY）培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，1.34%（质量分数）无氨基酵母氮源（YNB），1%（质量分数）甘油，0.4 mg／L生物素）的5L发酵罐中，参数控制：温度为28℃，pH值为6.30，溶氧为20%～30%，转速：与溶氧联动（起始最低转速150r／min）.当甘油消耗尽时（根据溶氧急剧上升判断为甘油消耗尽），补加30mL 80%（体积分数，下同）甲醇诱导表达，此后按20mL／h的流速连续补加80%甲醇，发酵过程以质量分数为14%氨水调pH值，每隔3h取5mL培养液离心取上清电泳，共诱导51 h，发酵结束离心收集发酵上清.取不同时间发酵上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，质量分数为14%聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS－PAGE），最后收集的发酵上清用于进一步纯化.1.2.2 IFN－ω的纯化超滤浓缩：用平衡缓冲液（100mmol／L NaAc，pH 6.0）将 MilliporeP2B005A01超滤膜平衡，超滤浓缩发酵上清20倍，加入等体积的平衡缓冲液替换，如此重复替换10次，最后将蛋白缓冲液体系替换成平衡缓冲液体系.强阳离子交换柱（SP）层析柱分离：A液：100 mmol／L NaAc，pH 6.0，B液：400mmol／L NaAc，pH 6.0；将超滤样品上样于Φ18mm×200mm SP Sepharose Fast Flow层析柱，然后以5mL／min流速用 A液冲洗3个柱体积冲洗未挂柱蛋白，用30%（体积分数，下同）B冲洗3个柱体积，收集30%B洗脱峰样品并电泳检测.梯度洗脱：以流速2.5mL／min，30%B→100%B，200min线性梯度洗脱，分管收集洗脱样品.收集样品分别取样进行SDS－PAGE.1.2.3 IFN－ω质谱鉴定分子质量利用 MALDI－TOF－TOF MS，Daltonics autoflexⅢ，Bruker测定Ⅱ峰样品的分子质量，线性阳离子模式（LP＿ProtMix），离子加速电压为20kV.取样品1μL与含0.1%（体积分数）三氟乙酸的70%（体积分数）乙腈溶液的饱和α－氰基－4－肉桂酸溶液（HCCA）1 μL充分混合，取1μL点样，待自然干燥后质谱分析.1.2.4 IFN－ω氨基酸序列分析采用Edman降解法测定II峰样品的N端15个氨基酸序列，N端蛋白序列分析仪可自动显示测序峰.1.2.5 IFN－ω活性测定参照文献［15］用细胞病变抑制法测定活性：37℃、5%（体积分数，下同）CO2贴壁培养人羊膜（WISH）细胞，并扩增，消化、收集细胞，将细胞配制成浓度为3×105 mL－1的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，培养至形成均匀的细胞单层.用杜尔贝科改良型（DMEM）完全培养液稀释IFN－ω标准品、自制IFN－ω，4倍梯度稀释，共8个梯度，每个梯度2复孔.将稀释好的IFN－ω标准品、自制IFN－ω加入细胞培养液中保护细胞，同时设置阴性对照组，于37℃，5%CO2培养18～24h.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入100μL含100组织半数感染剂量（TCID50）的水泡性口炎病毒（VSV）病毒攻击细胞，于37℃，5%CO2培养24h.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入结晶紫染色液30μL，室温放置30 min后，冲去染色液，加入脱色液100μL，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度.计算IFN－ω的活性.2 结果2.1 IFN－ω的发酵表达用SDS－PAGE检测发酵过程不同诱导时间样品，结果表明发酵上清中主要有两条蛋白条带，一条蛋白分子质量约为23ku，该蛋白相对分子质量大于IFN－ω理论分子质量，推测可能为糖基化所致（在目的蛋白的氨基酸序列中，有一个潜在的糖基化位点Asn78－Met79－Thr80），另一条蛋白分子量约为20ku，可能为非糖基化的IFN－ω，整个发酵过程中糖基化IFN－ω比非糖基化IFN－ω的表达量高（图1）.图1 IFN－ω的发酵培养液上清电泳结果Fig.1SDS－PAGE analysis of IFN－ωfermentation在发酵过程，蛋白的总表达量随着诱导时间的延长而增加.诱导27h前，非糖基化的IFN－ω的表达量高于糖基化的IFN－ω，诱导27h后糖基化的IFN－ω的表达量快速增加，而非糖基化的IFN－ω的表达量增加量较少，可能是因为随着发酵时间的延长，各种代谢产物逐渐累积，代谢产物的累积会对蛋白有降解作用，猜测糖基化的IFN－ω比非糖基化的IFN－ω的稳定性好，比较不容易降解，所以表现为糖基化的IFN－ω增加较多.在诱导33h后糖基化比非糖基化的IFN－ω表达量高，在诱导48h时糖基化和非糖基化的IFN－ω表达量均达到最高，51h的表达量与48h的表达量基本一致，表达量不再增长，说明诱导48h时表达量达最高，随后维持相对稳定，这可能与随着发酵时间的延长，各种代谢产物的累积对蛋白表达和累积有影响.通过电泳估算，在诱导48h时，糖基化和非糖基化的IFN－ω的总表达量约为80mg／L.2.2 IFN－ω的纯化超滤结果：IFN－ω的发酵培养液上清通过超滤得到浓缩（电泳结果如图2）.用毕赤酵母表达IFN－ω的培养上清中含有较少的背景蛋白，主要的杂质为色素、盐等，采用超滤方法来初步纯化，可达到快速去除色素、浓缩蛋白、降低蛋白体系中的电导的目的.SP Sepharose Fast Flow 层析柱分离结果（如图3）：30%B洗脱出一个峰（Ⅰ峰），收集1号管，经30%B→100%B，200min线性梯度洗脱得到两个峰（如图中Ⅱ峰和Ⅲ峰），其中2～5号管收集为Ⅱ峰，6～7号管收集为Ⅲ峰.SDS－PAGE检测结果（图4）：1号管样品主要为杂蛋白；2～5号管主要蛋白分子质量约为23 ku，为糖基化的IFN－ω，其中5号样品含有极少量的约20ku的非糖基化的IFN－ω；6号管样品含有糖基化和非糖基化的IFN－ω，7号管样品为非糖基化的IFN－ω.从图可以看出，通过梯度洗脱，糖基化和非糖基化的IFN－ω已得到有效分离，Ⅱ峰主要为糖基化的IFN－ω，Ⅲ峰主要非糖基化的IFN－ω.图2 IFN－ω超滤样品电泳结果Fig.2SDS－PAGE analysis of IFN－ωultrafiltration图3 IFN－ωSP液相分离图谱Fig.3Liquid chromatogram of IFN－ωSP2.3 鉴定分子质量及N端测序用autoflexTOF／TOF质谱仪分析SPⅡ峰样品，质谱图如图5.质谱分析得到的质谱峰并非一尖峰，而是一簇宽峰，这是由于糖蛋白糖基化的不均一性导致峰形展宽，所得的质谱峰约在23ku附近，其测定结果约比理论值（19 984.2u）大3 000u，猜测这是由于IFN－ω的Asn78糖基化所致.图4 IFN－ωSP液相分离样品电泳结果Fig.4SDS－PAGE analysis of IFN－ωSPN端测序结果15个氨基酸及排列顺序为：EAEACDLPQNHGLLS.图5 糖基化的IFN－ω质谱分析图谱Fig.5Mass spectrogram of glycosylation IFN－ω2.4 活性测定活性测定结果：应用 WISH－VSV细胞病变抑制法测定糖基化IFN－ω的活性，分别以IFN－ω标准品、IFN－ω待测品作标准曲线，四参数回归计算法进行处理，结果显示纯化后的糖基化IFN－ω抗病毒活性良好，ED50约小于40pg／mL，糖基化IFN－ω活性约与标准品活性相当，通过下列公式计算，抗病毒活性换算后为1.46×108 U／mL：待检样品效价（生物学活性）（U／mL）＝其中：C1为待检样品相当于标准品半效量的稀释倍数；C2为标准品半效量的稀释倍数；D1为待检样品预稀释倍数；D2为标准品预稀释倍数.3 讨论本文采用毕赤酵母表达IFN－ω，酵母是生产真核异源蛋白的宿主菌，易于遗传操作，兼有原核生物生长特性及真核蛋白的翻译后加工修饰特点.巴氏毕赤酵母在表达外源蛋白时具有可高密度培养、表达量高、稳定性高、能对所分泌的蛋白进行N－和O－糖基化修饰、适应性强、易于处理、自身分泌的蛋白较少等优点［16］，毕赤酵母在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物，通常为甘油，既可以满足细胞生长又能有效抑制外源基因表达，在表达阶段，只需让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导即可，这样高密度连续培养可以提高表达量.由于毕赤酵母自身分泌的蛋白质量很低，在培养上清中，重组蛋白的比例就相对较高，为蛋白质纯化建立基础［17］.由于该表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白.毕赤酵母表达IFN－ω的培养上清中含有较少的背景蛋白，主要的杂质为色素、盐等，但培养液的体积较大，因此实验过程第一步采用超滤膜来捕获目的蛋白，可达到快速去除色素、浓缩蛋白、降低蛋白体系中的电导的作用，SP层析分离过程通过延长洗脱梯度即可将糖基化和非糖基化的IFN－ω较好地分离，得到具有较高生物活性的糖基化IFN－ω.糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即在糖基化发生过程中会产生一系列结构相关的糖链（微不均一性）以及同一糖蛋白中的不同糖基化位点连接有不同的糖链（点不均一性），同时由于糖基化的发生由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造成即使同一个位点也会有糖基化程度［18］.质谱分析糖基化的IFN－ω，质谱图谱峰并非单一的尖峰组成，而是一簇宽峰，这是由于IFN－ω的糖基化的不均一性导致峰形展宽.本实验为进一步研究IFN－ω的结构和生物学特性、发掘其药物价值以及IFN－ω的生产奠定了基础.【相关文献】［1］李臣宾.IFN－ω的研究进展［J］.国外医学免疫学分册，2005，28（1）：7－9.［2］Bekisz J，Schmeisser H，Hemandez J，et al.Human inter－ferons alpha，beta and omega［J］.Growth Factors，2004，22（4）：243－251.［3］许无恨，刘慧玉，薛刚，等.猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测［J］.中国兽医学报，2009，29（8）：1036－1040.［4］Adolf G R，Maurer－Fogy I，Ingo K I，et al.Purification and characterization of natural human interferonω1：two alternative cleavage sites for the signal peptidase ［J］.The Journal of Biological Chemistry，1990，265：9290－9295.［5］Yang L M，Xue Q H，Sun L，et al.Clning and characterization of a novel feline IFN－ω［J］.Inteferon Cytokine Res，2007，27：119－127.［6］Hennet P R，Camy G A，McGahie D M，et parative efficacy of a recombinant feline interferon omega in refractory cases of calicivirus－positive cats with caudal stomatitis：a randomized，multi－centre，controlled，doubleblind study in 39cats ［J］.Journal of Feline Medicine and Surgery，2011，5（13）：577－587.［7］Mitchell M S.Cancer vaccines，a critical review Part I［J］.Curt Opin Investig Drugs，2002，3（1）：140－148.［8］Mathias M P，Hdga M，Peter L，et al.Open－label study of omega interferon in previously untreated HCV－infected patients［J］.Journal of Hepatology，2002，36（6）：125.［9］Adolf G R.Human interferon omega－a review［J］.Muh Seler，1995，1（Sup.1）：S44－S47.［10］Liu H，Pan H C，Peng L，et al.RP－HPLC determination of rccombinant human interferon omega in the Pichia pastoris fermentation broth［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，38（4）：734－737.［11］左爱军，梁东春，郭刚，等.重组人ω－干扰素的制备及活性分析［J］.中国免疫学杂志，2006，22（10）：940－943.［12］齐连权，付玲，于长明，等.人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化［J］.军事医学科学院院刊，2003，27（4）：268－270.［13］Meynial－Sallers I，Combes D.In vitro glycosylation of proteins：an enzymatic approach ［J］.Journal Biotechnology，1996，46（1）：1－14.［14］郑成已.人ω干扰素基因工程菌发酵条件的优化［J］.海峡药学，2006，18（3）：168－170.［15］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.［16］Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast pchia patoris［J］.Fems Microbiology Rev，2000，24（1）：45－66.［17］Rornanos M A，Clare C A，Clare J J.Foreign gene expression in yeast：a review ［J］.Yeast，1992，8（2）：423－488.［18］Dell A，Morris H.Glycoproein structure determination by mass spectrometry ［J］.Science，2001，291：2351－2356.。

恶性疟原虫融合蛋白PfCP-2.9自由巯基的测定钱锋;潘卫庆【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》【年(卷),期】2003(21)2【摘要】目的检测由毕氏酵母表达的恶性疟原虫融合蛋白(Plasmodium falciparum chimeric protein)PfCP-2.9的自由巯基。

方法使用反向高压液相层析和Ellman氏反应进行检测。

用反向高压液相,检测了3种样本,PfCP-2.9、PfCP-2.9经二硫苏糖醇还原、PfCP-2.9经吲哚乙酸烷基化。

结果两种检测方法均表明PfCP-2.9不含任何自由流基。

结论由毕氏酵母表达的PfCP-2.9中的半胱氨酸残基所含有的硫基均已氧化形成二硫键。

【总页数】3页(P99-101)【关键词】恶性疟原虫;融合蛋白;毕氏酵母;PfCP-2.9;自由巯基;反向高压液相层析法;Ellman氏反应【作者】钱锋;潘卫庆【作者单位】第二军医大学病原生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R382.31;R531.3【相关文献】1.肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的制备和耐热肠毒素抗体测定 [J], 郑继平;刘向昕;王令春;王芃;李淑琴;张兆山2.沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达 [J], 夏天;刘建湘;姚景宏;吴太鼎;刘子建;杨述华3.血清中总巯基与非蛋白巯基含量分别测定研究 [J], 陈震阳;苏春云4.恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析 [J], 王瑞;钱锋;曲莉;潘卫庆5.恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性(英文) [J], 薛向阳;张青锋;邢金花;潘卫庆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

毕赤酵母提高产肠毒素大肠杆菌灭活疫苗免疫保护效果的研究李莹慧;张迪;张兆天;刘迎迎;朱悦;贾垌;卢海强;李妍【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2022(44)12【摘要】为探究毕赤酵母提高产肠毒素大肠杆菌(ETEC)灭活疫苗免疫保护效果的作用,本研究将48只BALB/c小鼠随机均分为4组,分别为毕赤酵母活菌+疫苗组(仔猪大肠埃希氏菌K88、K99、987P三价灭活疫苗)、毕赤酵母灭活菌+疫苗组、疫苗组及生理盐水(对照组)。

免疫后15 d各组随机取6只小鼠采血后剖杀采集其十二指肠样品及肠液,分别采用ELISA检测各组小鼠血清K88ac(菌毛)IgA和K88ac IgG特异性抗体水平与十二指肠液中K88ac分泌型IgA(SIgA)抗体水平;采用q PCR检测十二指肠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1及黏蛋白MUC2基因的转录水平;制备小鼠十二指肠组织切片,观察其肠道结构完整性,采用Image J 1.41软件定量分析小鼠肠绒毛高度与隐窝深度;对各组小鼠脾脏称重,计算脾脏指数。

采用腹腔注射ETEC K88ac菌株(3×10^(7)cf u/只)方式对每组剩余小鼠攻毒,连续5 d观察各组小鼠的临床症状,统计小鼠的腹泻率和死亡率并称量其体质量。

通过以上检测指标综合分析毕赤酵母对提高灭活疫苗保护效果的作用。

抗体检测结果显示,与疫苗组及对照组相比,添加毕赤酵母活菌与灭活菌均可极显著(P<0.01)提高小鼠血清K88ac IgA、K88ac IgG及十二指肠液中K88ac SIgA特异性抗体水平,且活菌效果极显著(P<0.01)或者显著(P<0.05)优于灭活菌及其他组。

qPCR结果显示,与疫苗组相比,添加毕赤酵母活菌或灭活菌均可显著提高小鼠十二指肠紧密连接蛋白基因的转录水平(P<0.05),极显著提高小鼠十二指肠黏蛋白的转录水平(P<0.01)。

组织切片观察可见,活菌+疫苗组小鼠肠道肠壁绒毛排列相对整齐,绒毛结构基本完整,隐窝清晰,优于灭活菌+疫苗组及其他组。

PCV2 Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及小鼠免疫试验的开题报告题目：PCV2 Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及小鼠免疫试验研究背景：猪圆环病毒2型(PCV2)是一种常见的猪病毒，可引起多种临床症状，如呼吸道症状、消瘦、瘫痪等。

目前，疫苗是预防和控制该病的主要手段。

而PCV2 Cap蛋白是一种重要的抗原蛋白，是开发PCV2疫苗的重要组成部分。

因此，研究如何高效、经济地制备PCV2 Cap蛋白为制造PCV2疫苗具有重要的理论和实践意义。

研究内容：本研究将采用基因重组技术将PCV2 Cap基因克隆至毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建pPICZαA-PCV2 Cap表达载体，并将其转化至毕赤酵母Pichia pastoris中，应用甲醇诱导表达的方法进行大规模生产。

通过Western blot和ELISA检测毕赤酵母中PCV2 Cap蛋白的表达。

利用小鼠模型，对表达的PCV2 Cap蛋白进行免疫试验，探究其免疫效果。

研究意义：本研究通过毕赤酵母重组技术，高效、经济地制备PCV2 Cap蛋白，为PCV2疫苗的制造提供了一种新途径。

同时，研究表明毕赤酵母表达的PCV2 Cap蛋白能够有效地提高小鼠体内的抗体水平，具有明显的免疫效果，为探索PCV2疫苗的进一步研发提供了新思路。

参考文献：1. Trible, B. R., & Rowland, R. R. R. (2012). Advances in porcine circovirus type 2 vaccines, immunology, and diagnostics. Veterinary microbiology, 156(3-4), 189-197.2. Genzati, I. G., Gardey-Loubat, A., Lozano, E. S., & Odeón, A. C. (2016). Expression and immunogenicity of Porcine circovirus type 2Capsid protein subunits produced in vivo in lettuce (Lactuca sativa) plants. Plant Molecular Biology Reporter, 34(5), 1078-1088.3. Zhou, J. Y., Shang, S. B., Gong, H. S., Chen, Q. X., Jiang, W. M., Yang, J. Y., & Fang, L. R. (2011). Expression of the PCV2 ORF2 protein in Lactococcus lactis and evaluation of its immunogenicity as an oral vaccine in mice. Protein and peptide letters, 18(4), 405-411.。

基于毕赤酵母制备的SARS-CoV2RBD-重组蛋白疫苗的免疫方案优化及不同佐剂对中和抗体滴度的影响王恒;蒋荩芳;刘柯;马庆庆【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2024(45)1【摘要】目的对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考。

方法将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA 质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性。

结果目标蛋白wtRBD 和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d 间隔时间的IgG抗体滴度增加了1.8倍(44923 vs.80507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2191vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了32255(2167~88084);在采用5μg或30μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P>0.05)。

结论基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考。

【总页数】10页(P69-78)【作者】王恒;蒋荩芳;刘柯;马庆庆【作者单位】遵义医科大学附属航天医院检验科;遵义医科大学附属航天医院中心实验室【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.毕赤酵母表达的含前S1、前S2和S表位乙肝表面抗原疫苗的制备和免疫原性研究2.密码子优化的(GGGGS)3对重组人血清白蛋白在毕赤酵母中表达的影响3.添加脂质体和明矾佐剂的戊肝病毒的重组中和表位蛋白免疫小鼠的不同免疫效应4.重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第四军医大学硕士学位论文毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺研究姓名：唐浩申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：陈志南;米力@缩略语表缩略语英文全称中文全称A absorbance 吸光值Ab antibody 抗体AK auto Ab anti-keratin auto antibody 抗角蛋白自身抗体 AOX alcohol oxidase 醇氧化酶bp base pair 碱基对CHO Chinese Hamster Ovary 中国仓鼠卵巢CV column volume 柱体积DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸DO dissolved oxygen 溶解氧Elisa enzyme linked immunosorbentassay酶标记免疫吸附试验Fab antigen-binding fragment 抗原结合片段 FDA food and drug administration 食品与药品管理局 FF fast flow 快速流GA glucoamylase 葡萄糖淀粉酶 HBsAg hepatitis B surface antigen 乙型肝炎表面抗原 HC heavy chain 重链HIC hydrophobic interactionchromatography疏水作用层析HPLC high performance liquidchromatography高效液相色谱HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IEC ion exchange chromatography 离子交换层析 Kd kilodalton 千道尔顿L liter 升LC light chain 轻链MAb monoclonal antibody 单克隆抗体独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

北京化工大学硕士学位论文重组表达载体pPIC9K-Hepcidin的构建及其在毕赤酵母中的表达和鉴定姓名：***申请学位级别：硕士专业：环境工程指导教师：***20050615北京化工大学硕士学位论文子。

与以往在植物１９］、昆虫类Ｉｌｏｌ、和软件动物㈣发现的抗菌多肽一样，人类Ｈｅｐｃｉｄｉｎ也具有广泛的抗菌、抗真菌、抗原生动物的作用。

图１＿１Ｈ印ｃｉｄｉｎ的结构示意图Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因位于人的第１９号染色体上，而小鼠则位于第７号染色体上。

ＨｅＤｃｉｄｉｎ基因由三个外显予和两个内含子组成，转录后的ｍＲＮＡ长约为Ｏ．４ｋｂ。

其中第三个外显子编码了Ｈｅｐｃｉｄｍ的氨基酸序列。

人、大鼠和小鼠Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的基因结构极为相似，在Ｈ印ｃｉｄｉｎ基因上游，均与ｕｓＦ２（ｕｐｓｔｒｅ锄ｓｔｉｎａｍａｔｏ巧ｆ．ａｃｃｏｒ２）基因紧密相连。

两个基因中间只有１．２４ｋｂ的间隔，在这一部位存在着ｍ盯３Ｂ，Ｃ／ＥＢ邓，和ＮＦ—ＫＢ等潜在转录调节子以及１ｗｒＡ起始结合位点。

ＮｏｒｍｅｍＢｌｏｎｉｎｇ的分析结果显示，Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的基因在肝脏特异表达，心脏、脊髓、肺表达很少，前列腺、军丸、卵巢、小肠、结肠、肾脏和膀胱几乎没有表达［６一。

ＨｅｐｃｉｄｉＩｌ作为一种抗菌多肽，损伤、感染和炎症刺激可强烈引起该基因表达的增加【１２，１３］。

高铁饲料饲喂的小鼠，Ｈｅｐｃｉｄｉｌｌ基因表达也显着增加【１２】。

但ＨｅｐｃｉｄｉｎｍＲＮＡ没有铁反应组件（ＩＲＥ），所以Ｈ印ｃｉｄｉｎⅡ皿ＮＡ随铁状态而改变的机理目前尚不十分清楚垆Ｊ。

北京化工大学硕士学位论文白的作用下被氧化为三价铁，与转铁蛋白结合后在血浆中被运输到其它组织加以利用【５】（图１．２）。

图１．２ＰｒｏｐｏｓｅｄｓｔｅｐｓｉｎＨｅｐｃｉｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｍｎｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．（上）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｏｆｎ铀５ｆ咖ｉＩｌ＿ｂｏ恤ｄｉｒｏｎｂｙＴ矗也（ｏｒｅＸｐｏｓｕｆｅｔｏ１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈ撕ｄｅ）ｌｅａｄｓｔｏ（２）ｕｐｔａｋｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｐｒｏｄｕｃ廿０ｎａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎ，ｗｈｉｃｈ（兰）ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｔｈｅＢ２Ｍ椰Ｅ．Ｔ侬１ｒｅ劬ｌｔｉｏｎｂｙＲＥｍａｃｒｏｐ｝ｌａｇｅｄｕｏｄｅ删ｃｒｙｐｔｃｅｌＩｓ．（生）ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｒｏｎｕｐｔａｌ（ｅｏｒＣ叮ｐｔｃｅｌｌｓｄｉ丘色ｒｅｎｔｉａｔｅｉｒｌｔｏｄａｕｇｔｌ々ｅｒｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓｐｒｏＦ咖ｍｅｄｔｏｈａｖｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｒｏｎｎ狮ｓｐｏｒｔｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｌｅａｄｊｎｇｔｏ（量）ｄｅｃｒｅａＳｅｄｄｉｅ协ｒｙｉｒｏｎａｂｓｏｒｐ廿ｏｎ，１．３铁代谢调节除了月经，人体没有排出体内铁的生理机制。

基金项目:云南省自然科学基金资助项目(No:2004C0029Q).作者单位:中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物室(昆明650118).通讯作者:孙茂盛,E mail:yinna988@中国图书分类号 R392.11 Q 786 文献标识码 A 文章编号 1004 5503(2008)03 0185 05基础研究抗菌肽Cecropin D 在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定尹娜 李鸿钧 彭梅 谢天宏 张光明 施锐 孙茂盛摘要 目的 在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。

方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K 。

重组表达质粒pPIC9K D 转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0 5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM Sepharose 层析柱纯化,Tricine SDS PAGE 分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。

结果 经Tricine SDS PAGE 检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D 对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。

结论 抗菌肽Cecropin D 成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

关键词 抗菌肽;Cecropin D;毕赤酵母;分泌表达;抗菌活性Expression of Antibacterial Peptide Cecropin D in Pichia pastoris and Purificationand Activity of Expressed ProductYIN Na,LI Hong jun,PE NG Mei,et al(Instiute o f Medical Biolo gy ,Peking Union Medical College,Chinese Academ y o f Medical Sciences,Kunming 650118,China )Abstract Objective To express antibacterial peptide cecropin D in Pich ia p astoris and determine the activi ty of expressed product.Methods Six oligonucleotide fragments were synthesized according to the codon bias of Pichia pastoris ,then phosphorylated,annealed,linked and cloned to expression vector pPIC9K.The constructed recombinant plasmid pPIC9K D was transformed to Pichia p astoris GS115,and posi ti ve clones were screened with G418for expression under induction of 0.5%methanol.T he expressed product was puri fied by C M Sepharose chromatography,idntified by Tricine SDS PAGE,and determined for antibacterial activi ty by agarose diffusion test and turbidimetry.Results Cecropin D wi th a relative molecular mass of about 3900was expressed and reached a puri ty of more than 90%after purificati on.It showed antibacterial activi ty to both Gram positive and negative bacteria.C onclusion Cecropin D was successfully expressed in Pichia p astoris ,which laid a foundation of further study on antibacterial peptide.Key w ords Antibacterial peptide;Cecropi n D;Pichia pastoris ;Secretory expression;Antibacterial activity1975年瑞典科学家B oman 等人从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种抗菌肽,并将其命名为Ce cropin 。

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化【摘要】目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。

方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因，克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中，重组载体线性化后，转化毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达。

应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物，采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。

结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%；表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%；测得其比活为5．2×104AU/mg。

结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。

【Abstract】Objective To study the expression staphylokinase gene in Pichia pastoris and the purification of expression product .Methods An artificial gene for staphylokinase was synthesized by using favored codons of the yeast Pichia pastoris.The gene was cloned into the secretory expression vector pPIC9K,and the recombinant vector was linearized and transformed into GS115,transformants had expression after inducement with methanol.The recombinant protein was purified through the steps of DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200,and bioactivity was analyzed.Results The expression of staphylokinase in Pichia pastoris came up to 45%of total proteins;The recombinant protein was further purified by DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200 to the 95%purity;purified was more than 5．2×104AU/mg.Conclusion Staphylokinasehas been expressed inPichia pastoris and purified successfully【Key words】Staphylokinase;Pichia pastoris；Expression and purification葡激酶(SAK)是金黄色葡萄球菌产生的一种胞外激酶，能特异地激活血浆纤溶酶系统溶解血栓。

毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述发布时间：2021-11-01T06:56:24.297Z 来源：《科学与技术》2021年第21期作者：徐倩[导读] 巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一徐倩（义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南三门峡，472300）摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。

本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。

关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化1.前言1.1背景和意义近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。

微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。

它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。

发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。

要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。

而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。

菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。

以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。

它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化孙玮遥;宋增健;王向东;林剑【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)002【摘要】该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母(Pichia pastoris) NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律.研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2％,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍.【总页数】4页(P54-57)【作者】孙玮遥;宋增健;王向东;林剑【作者单位】烟台大学生命科学学院,山东烟台264005;烟台大学生命科学学院,山东烟台264005;山东大学医学院,山东济南250100;烟台大学生命科学学院,山东烟台264005【正文语种】中文【中图分类】Q815【相关文献】1.巴斯德毕赤酵母表达重组人对氧磷酶1的r发酵条件优化 [J], 廖一波;于子桐;潘力;叶燕锐2.重组毕赤酵母发酵表达人乳头瘤病毒病毒样颗粒培养工艺条件的优化 [J], 赵晶;王泽建;郭美锦;储炬;张嗣良;楼觉人3.毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白发酵条件的优化 [J], 高宇;赵红蕾;冯新;刁昱文;刘珊珊;李林溪;顾敬敏;韩文瑜;雷连成4.蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达 [J], 张赛南;施柳佳;廖志银;王珍;王首锋5.基因重组毕赤酵母产蛋清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化 [J], 宋增健;薛松;王向东;林剑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达姜月华;宋健;王健伟;韩金祥;洪涛【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2006(26)7【摘要】目的:获得具有抗凝活性的重组线虫抗凝肽(NAP)蛋白,为新型抗凝药物的开发奠定基础。

方法:将pPIC3．5K-rNAP质粒转化毕赤酵母菌株GS115,筛选出阳性菌株后,用甲醇诱导表达。

收集酵母培养上清,用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,通过测定PT(血浆凝血酶原时间)、INR(血浆凝血酶原国际标准化比率)和APTT(活化部分凝血活酶时间)来验证其生物学活性。

结果:获得了稳定表达NAP的重组酵母菌株。

重组NAP被分泌表达,其分子量比预计分子量(8．7kDa)稍大,约为10kDa左右,可能与糖基化有关。

体外活性检测证实其有较强的抗凝活性。

结论:在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的重组线虫抗凝肽,可用于新型抗凝药物的开发。

【总页数】5页(P37-41)【关键词】重组线虫抗凝肽;酵母;表达;抗凝活性【作者】姜月华;宋健;王健伟;韩金祥;洪涛【作者单位】山东省病毒学研究所暨山东省医学病毒学重点实验室;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.三疣梭子蟹PtCrustin3成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达 [J], 卢希阳;陶妍2.蜱抗凝血肽与RGDS肽重组基因在毕赤酵母中的表达及活性分析 [J], 蒋香梅;叶彬;白垚;武卫华;郑玉强3.厚壳贻贝Mytilin-1成熟肽在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性 [J], 张亚莉;陶妍;谢晶;钱韻芳4.一种新型抗菌肽Hydramacin-1在毕赤酵母中的重组表达、纯化及其抗菌活性[J], 孟德梅; 石林玥; 李文娟; 孙雪晴; 郭雅君; 贾雪霞; 樊振川5.重组牛乳铁蛋白肽衍生肽设计及其在毕赤酵母中的表达 [J], 吕自力; 张恩鹏; 郭爱珍; 罗斌; 梁鑫; 单旭东; 庄静; 张霞; 王亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。