4第四章 目的基因的制备2

《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。

它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。

1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。

此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。

（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。

这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。

（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。

基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。

二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。

1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。

（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。

（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。

（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。

三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。

它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。

1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。

（2）药物作用机制明确，针对性强。

（3）生产周期较长，生产成本较高。

（4）药物质量和安全性要求严格。

1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。

第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。

通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。

原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。

目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。

要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。

二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。

一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。

对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。

获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。

2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。

缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。

3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。

4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。

5、人工化学合成法。

6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。

目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。

第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。

《基因工程》考试大纲及参考书一、课程性质与考试基本要求基因工程是建立在分子生物学和遗传学基础之上的一门核心技术，它的显著特点是能够跨越生物种属之间不可逾越的鸿沟，打破常规育种难以突破的物种界限，开辟在短时间内改造生物遗传特性的新领域。

《基因工程》是介绍在分子水平上对基因进行操作的一门学科。

通过本课程的学习和考试，使学生能系统的掌握基因工程的基本理论、基本知识和基本操作技能，培养学生创新思维、实践能力和科学素养，并且能够运用本学科的基本理论和技能，解释实践中的一些实际问题。

二、考试方法闭卷考试总分：100分考试时间：2小时三、试题类型名词解释、简答题、论述题四、参考书：袁婺洲主编，《基因工程》，第二版，化学工业出版社五、课程考试内容及要求第一章基因工程概述1、基因工程的概念2、基因工程的基本流程第二章基因工程工具酶1、限制性核酸内切酶的特征2、影响限制性核酸内切酶酶切反应的因素3、限制性核酸内切酶酶切位点的引入与消失4、DNA连接酶、DNA聚合酶类、碱性磷酸酶、Cas核酸内切酶第三章基因工程载体1、克隆载体2、表达载体第四章目的基因的获取与制备1、从基因文库获取目的基因2、PCR 获取与扩增目的基因第五章目的基因导入受体细胞的方法1、把目的基因导入大肠杆菌2、把目的基因导入动物细胞第六章阳性转化自的鉴定1、遗传表型检测法2、酶切电泳检测3、PCR 扩增鉴定筛选4、DNA序列测定第七章基因工程在基因功能研究中的应用1、基因的表达谱研究技术2、基因的突变研究技术3、基因敲除技术4、基因编辑技术5、基因敲减技术6、基因过表达与异位表达技术7、基因的相互作用研究技术第八章转基因动物1、动物转基因技术2、转基因动物的筛选与检测3、转基因动物的现状与应用。

基因工程复习题第一章1，基本概念：移动基因：（又叫跳跃基因或转座子）是染色体DNA上可复制和位移的一段DNA序列。

断裂基因：编码序列不连续的间断基因。

重叠基因：同一段DNA片段能够编码两种甚至多种蛋白质分子。

假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

重复序列：基因序列的多拷贝。

基因家族：由功能相关的基因成套组合形成。

哪些是真很和生物所特有的基因：断裂基因、假基因、重复序列。

基因工程（重组体DNA技术）：指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体结合成一个复制子，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，二能持续稳定的繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。

*3、基因工程的基本过程（步骤）。

切—接—转—增—检P16①目的基因制取②基因载体的选择与构建③目的基因与载体DNA的拼接④重组体分子导入受体细胞⑤外源基因的表达和产物的分离纯化第二章*寄主细胞控制的限制与修饰P20①宿主控制限制---核酸限制性内切酶②宿主控制修饰---修饰的甲基转移酶以λ(k) 噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

λ(k)感染B菌株↙↘大量的噬菌体少量的在被限制前发生甲基化DNA被限制↓传代甲基化链迅速增多↓限制被阻止↓少量具有B菌株修饰的λ(B)群体两种酶的作用：R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶——修饰一种是核酸内切限制酶——限制*2、核酸内切酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型酶的基本特性P22内切酶Ⅰ型①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM和Mg 2+辅助因子③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成④有特定的识别位点⑤切割方式：切割的核苷酸顺序无专一性内切酶Ⅱ型①有内切酶活性和甲基化酶活性——分开反应②能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构④切割可形成两种核苷酸切割末端————粘性末端和平末端内切酶Ⅲ型①由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活性②需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，且它的切割位点也是没有特异性的3、基本概念：粘性末端：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。

基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。

第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。

遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。

包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。

狭义：基因工程。

克隆：无性(繁殖)系或纯系。

指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。

2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。

A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。

4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。

同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。

同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。

平末端：DNA片段的末端是平齐的。

目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。

该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。

在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。

通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。

2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。

该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。

优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。

在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。

然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。

通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。

3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。

该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。

在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。

然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。

通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。

4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。

该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。

优点是精度高，易于实现定向编辑。

在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。

然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。

5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。