人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立

裸鼠移植瘤方法建立-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One11.细胞准备：用 PBS 清洗细胞两遍，加入胰酶消化，吹打离心，无血清培养基清洗两次，然后用无血清培养基将细胞重悬，进行细胞计数，使得 200μL 悬浮液里面含有 1×107个细胞。

总共需要细胞: 18（只）*200ul*=×107个，将混合好的细胞放于4°C冰盒运至动物房。

2.裸鼠准备：3周龄小鼠饲养一周后，每只于右侧腋腹壁皮下接种MDA-MB-231和MCF-7细胞 1×107/200μ L。

每日观察肿瘤生长情况, 待出瘤后使用游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积=(D×d 2 )/2(D表示肿瘤的长径, d表示肿瘤的短径)。

（注射器型号BD一次性使用无菌胰岛素注射器规格：1ml 25G）当肿瘤体积约为80 mm 3 时(100至150左右)，将裸鼠进行随机分成3 组（肿瘤大小，体重尽量接近），每组3只。

对照组，TO901317组，DADS组。

每天（每天给药会不会太频繁可以查阅相关类似成药的半衰期或综合国外文献的数据）将实验组灌胃TO901317，剂量为25mg/kg/d，将粉末状的 TO901317 溶解到蓖麻油（或芝麻油以及生理盐水）里，每只裸鼠注射含有 TO901317 的蓖麻油 200μL；对照组注射等体积的蓖麻油。

连续注射两周。

（12号灌胃针头，每次用后一定要煮沸消毒）（灌胃进针时针头偏右，一般就不会进肺了）腹腔注射DADS，剂量为50mg/kg (含10%小牛血清的D ME M培养液（最好使用生理盐水）)每次注射200 μL , 隔日注射, 连续7次给药。

每2～3d观察测量1次, 计算肿瘤相对体积(RTV)。

以每组动物移植瘤体积的平均值, 绘制移植瘤生长曲线。

实验结束时在超净工作台上对裸鼠进行拍照，完整剥离肿瘤，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，用电子天平称量移植瘤重量，用手术剪取出肿瘤，拍照。

人胃癌组织块裸鼠原位移植 转移模型的建立刘　平1,赵志泉1,张小勇1,潘世扬2,杨国平2,丁小健2摘　要:目的　用肿瘤组织块原位移植,建立人胃癌裸小鼠原位移植 转移模型。

方法　以人胃低分化腺癌细胞系接种于裸小鼠皮下,形成稳定传代的皮下移植瘤,再取该肿瘤组织块原位移植于裸鼠胃壁,观察移植肿瘤的生长状况、移植成功率和自发转移的发生率。

结果　原位移植成功率(成瘤率)为100%、局部淋巴结转移率100%、远处淋巴结转移率90%、肝转移发生率为75%。

荷瘤鼠的中位生存期为14周,晚期出现消瘦和全身衰竭。

结论　该裸小鼠原位移植 转移模型的生物学行为与人胃癌自然生长和转移过程相似,可作为一种有价值的工具用于胃癌转移机理和抗转移实验治疗的研究。

关键词:胃肿瘤;胃癌细胞;裸小鼠;疾病模型中图分类号:R 735.2 文献标识码:A 文章编号:100028578(2001)0120015202 收稿日期:2000201206;修回日期:2000204214基金项目:江苏省教委自然科学基金资助项目(95052)作者单位:1.210029南京医科大学第一附属医院消化科,2.中心实验室Establ ishm en t of Orthotop ic I m plan t M eta sta tic M odel of Hu manStomach Cancer usi ng I n tact Tu m or T issue i n Nude M iceL I U P ing ,ZHAO Zh i 2quan ,ZHAN G X iao 2yong ,et alD ep a rt m en t of D ig estive d isease ,T he F irst A f f lia ted H osp ita l ,N anj ing M ed ica l U n iversity ,N anj ing 210029,Ch inaAbstract :Objective To develop nude m ou se o rtho top ic i m p lan t m etastatic m odel of hum an gastric can 2cer u sing in tact tum o r tissue .M ethods T um o r cell line of hum an gastric adenocarcinom a w as inocu lated subcu taneou sly in to nude m ice to develop i m p lan t 2tum o r .In tact tum o r tissue w as then co llected and i m 2p lan ted o rtho top ically in to the nude m ou se stom ach .T he local tum o r grow th characteristics ,tum o r 2takerates and m etastasis rates w ere exam ined .Results A 100%tum o r 2take rate w as ob tained in the m odel.T he m etastases of local and distan t lym p h nodes ere ob served in 100%and 90%of the nude m ice resp ectivce 2ly .T he liver m etastases w ere found in 75%of the n i m als .T he m edian su rvival ti m e of the tum o r 2bearing nude m ice w as 14w eek s .Em acicati on and exhau sti on of the nude m ice w ere p resen ted in late stage of the exp eri m en t .Conclusion T he grow th and m etastasis characteristics of hum an stom ach cancer w ere exh ib itedin the o rtho top ic i m p lan t m etastatic m odel.T h is tum o r m odel m igh t be a u sefu l too l in the researches on m etastatic m echan is m s and an ti m etastasis treatm en t of hum an stom ach cancer .Key words :Stom ach neop las m s ;T um o r 2cells ;D isease m odel ;N ude m ou se 我国各种恶性肿瘤中胃癌的发病率居首位,占23%。

关于人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立及其生物学特性观察【摘要】目的建立一种能很好模拟人体内生物学行为的胃癌裸小鼠原位移植和转移模型。

方法采用人胃癌SGC-7901细胞株在裸鼠皮下经反复传5代形成实体瘤的完整组织块，建立人胃癌裸小鼠原位移植生长和转移模型16个。

观察所建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率，常规H-E染色光镜下观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移情况。

电镜下观察肿瘤超微结构及免疫组化S-P法检测肿瘤诱导型环氧化酶-2（COX-2）。

结果胃癌裸鼠原位移植块再次原位移植的原位成瘤率达100％（16/16），淋巴结广泛转移率为87.5%（14/16），肝转移发生率为75.0％（12/16），腹腔积液形成率为12.5%（2/16）。

结论原位移植和转移模型均具有人胃癌自然生长过程的特点，具有人胃癌的生物学活性。

【关键词】胃肿瘤肿瘤细胞原位移植疾病模型裸小鼠Abstract： Objective To develop a nude mouse model of human gastric cancer that can mimic its natural human biologic activities. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured in nude mice repeatedly for 5 generations to get the subcutaneous solid tumor， which was then emulsified and orthotopicly inplanted into the anterior wall of the stomach in 16 nude mice. The tumor growth characters， tumor-take rate and metastatic rate were studied grossly， the transplanted tumor and its lymphatic and hepatic metastases， after routine H-E staining; the ultrastructures， by electron microscopy; and COX-2， by immunohistochemical method． Results The tumor-take rate was 100％（16/16）， the rates of metastasis to lymph nodes and liver were 87.5％（14/16） and 75.0％（12/16） respectively， the rate of ascites formation was 12.5%（2/16）. Conclusion The model of human stomach cancer established is qualified， exhibiting natural growth characters and biological activities.Key words: stomach neoplasms; orthotopic thansplantation; disease model; nude mouse既往胃癌动物模型的建立多采用皮下接种方式，虽然这种移植方式简单易行，肿瘤的生长情况也便于观察，且在一定程度上也近似地模拟了原有肿瘤的形态学、生物学及生物化学特性；然而接种于裸小鼠皮下组织毕竟属于异位移植，脱离了其起源组织器官的微环境，因此在实验中移植瘤的某些行为常不同于患者原发恶性肿瘤的生物学行为。

裸鼠皮下移植瘤实验造模步骤顾名思义，这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。

种植的点也有讲究，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。

可根据实验设计选择移植点，统一移植点的位置，除了遵守实验统一的条件外，待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。

裸鼠（Balb/c 鼠，无毛发， T 淋巴细胞缺陷）是比较常见和常用的实验用鼠，尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。

裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。

当然，这种肿瘤模型也有缺陷，即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。

☞肿瘤细胞移植时的简要步骤首先准备好要移植的肿瘤细胞（细胞量根据不同肿瘤略有不同，我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择1x106 左右；肿瘤细胞可与基质胶 1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取，基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境，有助于肿瘤细胞生长）。

戴无菌手套后，将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤，然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。

将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒3 次。

右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器，在腹股沟或腋窝的位置，45 度斜角进针，注意不要突破腹膜，将针头保持于皮下位置。

然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下（肿瘤细胞量约1x106），快速退针，左手食指轻压针孔约1 min 后将小鼠放回饲养笼中，注意将小鼠侧放于垫料上，放置其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。

2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。

如果是利用肿瘤组织（人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代）建立裸鼠皮下移植瘤模型，则需要首先将肿瘤组织用无菌PBS（或1640 培养基）洗涤3 次，然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3体积的小块（种植前可裹基质胶）备用。

将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上，四肢用胶带固定，将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次，然后用眼科剪剪开约 0.5 cm 小口，小镊子将皮下筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部，每个位置放置 2～3 块肿瘤组织，注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。

人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法先用组织学完整的新鲜人肝癌组织接种于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型），并将其与直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型作比较。

一、间接肝原位移植瘤模型的制备1. 用新鲜的肝癌外科手术切除标本（来自长海医院，患者为1名47岁男性，病理诊断：肝左叶肝细胞癌，粗梁型，Ⅱ级），在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1～2 mm3小块。

2. 取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1 cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成1～2 mm3小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。

3. 取上述2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。

二、直接肝原位移植瘤模型的制备1. 同一例新鲜肝癌手术切除标本，处理方法同皮下移植，裸鼠处理同间接肝原位移植，取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头直接植入裸鼠肝右叶深部实质内。

2. 皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型的制备。

三、病理检查和相关指标检测1. 解剖和组织学检查（1）所有裸鼠接种后，分组分笼饲养，自由进食，每天观察1～2次。

（2）当裸鼠处于全身衰竭状态时处死并作大体解剖，对接种瘤和转移瘤分别进行观察、测量，记录肿瘤侵袭和转移情况，重要器官（主要为肝和肺）经10%中性甲醛固定后，常规石蜡制片，光学显微镜检查。

2. 周围血甲胎蛋白(AFP)检测处死前，均采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。

3. 瘤细胞DNA含量分析留取部分移植瘤标本采用流式细胞术进行DNA含量分析。

注意事项目前，肝癌的复发和转移仍然是其术后长期存活的主要障碍。

为了研究肿瘤的转移机制，建立接近于人体的肿瘤动物模型显得尤为重要。

人胃癌完整组织块裸鼠原位种植高转移模型的建立实验具体步骤及方法人胃腺癌SGC27901 细胞株，裸鼠皮下注射(2x106/L 细胞悬液) ，成瘤后反复传代形成实体瘤，以第6 代瘤源为组织材料，打开腹腔，通过生物胶粘贴法用OB 医用生物胶将瘤块粘贴在裸鼠胃壁胃大弯血管分布稠密处；待荷瘤鼠出现衰竭体征濒临死亡时处死解剖检查。

一、皮下种植瘤模型的建立和传代BALB/c nu/nu 裸鼠24 只，雄性，6 周龄，体质量18～20 g，SPF 级条件下饲养。

人胃腺癌细胞株SGC-27901，2x106/L 细胞悬液裸鼠皮下注射，成瘤后反复传代形成实体瘤，本组瘤源为第6代。

二、人胃癌组织块裸鼠原位种植模型的建立1. 实验动物术前禁食12 h，氯胺酮50 mg/kg 腹腔麻醉，常规消毒，选择左侧正中旁切口进腹，暴露胃壁，在胃大弯处近胃窦旁用1 mL无菌空针头划破胃壁浆肌层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹龛，植入1 块瘤组织块，并在瘤表面滴上1 滴OB 生物胶(由广州白云医用胶公司提供) ，使其覆盖瘤组织表面, 约40 s 凝固后将胃壁回纳入腹腔，0 号丝线缝合腹膜及皮肤，关腹。

2. 整个过程严格遵循无菌操作。

3. 所有模型动物无麻醉意外，SPF 级饲养。

4. 术后1 周内，死亡2 只。

5. 定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、腹部体征。

6. 当荷瘤鼠出现明显消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死解剖，取原位瘤体、肿大淋巴结、胸腹腔内脏器、收取腹水。

7. 所取标本以10% 甲醛固定，石蜡包埋、切片，H-E 染色，作组织病理学检查。

8. 实体瘤细胞染色体鉴定。

注意事项体外实验虽然能在一定程度上反映胃癌细胞的运动能力和侵袭能力，但是不能完全替代体内胃癌转移的器官环境及转移效果，因此体内移植模型成为肿瘤实验研究的主要方法。

以往多是皮下移植，但可能因皮下纤维包膜的包绕致转移较少。

近年研究表明，肿瘤细胞株原位种植裸鼠体内不能完全表达肿瘤的生物学特性，而完整组织块原位移植可显著提高转移率。

人胃癌高转移模型的建立实验具体方法及步骤用人胃癌组织块SGC-7901 原位移植于SCID小鼠，第4周末移植瘤向淋巴结和肝脏等器官转移，转移率达66. 7% ，第6 周末转移率高达100% 。

一、实验材料准备1. 雄性SPF 级SCID 小鼠，6～7 周龄，体重20～25g 。

2. 裸小鼠皮下传代的人胃癌组织( SGC-7901，低分化腺癌) 。

二、胃癌高转移模型建立1. SCID 小鼠25 只，随机分为试验组( n= 15) 和正常对照组( n= 10) 。

2. 试验组动物原位移植人胃癌组织SGC-7901：用4. 3%水合氯醛将动物麻醉后，依次切开左上腹皮肤、腹壁和腹膜，仔细暴露胃壁，在胃大弯中部用剪刀损伤胃浆膜层( 直径约3 mm)，用丝线将人胃癌组织块( 约5 mmx7 mm，重量为150 mg ) 缝在损伤处，然后将胃送入腹腔内，用0 号缝线依次缝合腹壁和皮肤。

3. 术后观察动物麻醉情况，直至全部动物清醒后，送至饲养室。

4. 正常对照组不作处理。

5. 手术后第2、4、6 周末分别随机处死试验组动物2、3、2 只，发现第6 周末2 只动物的癌肿均已转移，故余下8 只SCID 小鼠也于第6 周末处死。

6. 取胃局部生长的肿瘤组织、肿大淋巴结、脑，及胸腔、腹腔内脏器，以10% 福尔马林液固定，石蜡包埋，常规制片，HE 染色，光学显微镜下观察并记录肿瘤生长和转移情况。

注意事项原位移植包括原位接种人类肿瘤细胞株，或原位移植人类肿瘤组织块至裸鼠相应器官两种方法。

原位接种人癌细胞株可提高结肠癌、胰腺癌等少数肿瘤的转移率，但不能提高胃癌等人类肿瘤在裸鼠的转移率。

用人胃癌组织块原位移植方法建立裸小鼠胃癌转移模型，此法建立的模型癌转移率高达100% ( 向淋巴结和肝、肺等脏器转移)。

原位移植癌组织块至裸鼠相应的器官，可能由于保留了癌细胞之间的某些结构，移植癌能较好地反映人类肿瘤的浸润、转移特性。

SCID 小鼠为重度联合免疫缺陷小鼠，免疫功能较裸小鼠更为低下，因此更适宜作转移模型。

显微镜下人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立摘要】目的显微镜下建立一种能很好模拟人体内生物学行为的胃癌裸小鼠原位移植和转移模型。

方法采用人胃癌SGC-7901细胞株在裸鼠皮下反复传5代形成实体瘤，显微镜下将人胃癌裸鼠皮下移植瘤块种植于裸小鼠胃壁，建立胃癌裸小鼠原位移植和转移模型16个，观察建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率，常规HE染色，观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移的病理切片，电镜下观察肿瘤超微结构。

结果胃癌裸鼠皮下移植瘤原位移植的原位成瘤率达100％（16/16），淋巴结广泛转移率为87.5%(14/16)，肝转移发生率为75％(12/16)，腹水形成率为12.5%(2/16)。

结论显微镜下建立原位移植和转移模型成功率高，且具有人胃癌自然生长过程的特点和生物学活性。

【关键词】胃肿瘤肿瘤细胞原位移植疾病模型裸小鼠【中图分类号】R73-35【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）31-0110-03The establishment of orthotopic implant and metastatic models of human stomach cancer in nude mice under the microscopeLIN Qi , CHEN Hui-yu(Department of General Surgery, The First Hospital of Lianyungang City，Lianyungang, 222002，China)【Abstract】 Objective To develop a nude mouse model of human gastric cancer which can mimic its natural human biologic activities under the microscope. Methods Human gastric cancer SGC-7901 was cultured in nude mice repeatedly for 5 generations to get the Tumor subcutaneous solid tumor, which was then emulsified and orthotopicly implanted into the nude mouse stomach under the microscope to develop 16 implant-tumors. The tumor growth characteristic, tumor-take rates and metastatic rates were analyzed grossly. The gastric orthotopically transplantation, gastric cancer lymphatic metastasis and hepatic metastasis by HE staining, the ultrostructures, by electron microscopy were analyzed too.Results The tumor-take rate was 100％, the metastases of lymph nodes and livers were 87.5％ and 75％, ascites formation is 12.5%. Conclusion To repeat the model under the microscope is easy and qualified, which can exhibiting natural growth characters and biological activities successfully.【Key words】 stomach neoplasms tumor cells orthotopicthansplantation disease model nude mouse理想的人类肿瘤动物模型的建立是研究肿瘤生长和转移生物学以及寻求抗癌新药和新方法的重要工具。