以冻融法快速纯化高活力基因工程TaqDNA聚合酶

2023北京重点校高二（下）期中生物汇编基因工程章节综合一、单选题1．（2023春·北京海淀·高二海淀实验中学校考期中）基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，以便于重组和筛选。

已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—；限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—。

据图判断，下列操作正确的是（）A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割B．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割2．（2023春·北京海淀·高二海淀实验中学校考期中）下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制性内切核酸酶的酶切位点。

若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是（）A．B．C．D．3．（2023春·北京海淀·高二海淀实验中学校考期中）科学家将萤火虫的荧光素和荧光酶基因转入烟草细胞，获得高水平的表达。

长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。

这一研究成果表明（）Ⅰ萤火虫与烟草的DNA结构基本相同Ⅰ萤火虫与烟草共用一套遗传密码子Ⅰ烟草体内合成了荧光素和荧光酶Ⅰ萤火虫和烟草合成蛋白质的方式基本相同A．Ⅰ和ⅠB．Ⅰ和ⅠC．Ⅰ和ⅠD．ⅠⅠⅠⅠ4．（2023春·北京海淀·高二海淀实验中学校考期中）我国有历史悠久的传统发酵技术，以此为基础发展起来的发酵工程实现了发酵食品、药物等工业化生产，极大地改善了人们的生活。

下列相关叙述错误的是（）A．腐乳的鲜味来源于毛霉等微生物分泌的蛋白酶对豆腐中蛋白质的分解B．利用酵母菌等菌种的发酵工程生产的单细胞蛋白，可作为食品添加剂C．将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，再通过发酵可生产乙型肝炎疫苗D．发酵是指在无氧的条件下，利用微生物代谢将原料转化为人类所需要的产物的过程5．（2023春·北京海淀·高二海淀实验中学校考期中）在基因工程中常使用噬菌体作为载体。

taq酶冻干工艺Taq酶冻干工艺是一项重要的生物技术方法，广泛应用于分子生物学领域。

它以Taq酶为主角，通过冻干技术将其保存和利用，以实现高效、稳定的DNA扩增。

下面将从冻干工艺的原理、应用以及优势等方面进行阐述。

我们来了解一下Taq酶冻干工艺的原理。

Taq酶是一种从热泉中分离出的热稳定酶，具有较高的耐热性和DNA聚合酶活性。

在PCR （聚合酶链式反应）实验中，Taq酶起到了关键的作用，它能够在高温下扩增DNA模板，从而实现对DNA的复制。

然而，Taq酶的活性易受到环境条件的影响，如温度、湿度等。

为了保证Taq酶的活性和稳定性，科学家们开发出了冻干工艺。

冻干工艺的步骤相对简单，首先将Taq酶溶液冷冻至极低温，然后通过真空脱水的方式将水分从冷冻的Taq酶溶液中去除，最后将干燥的Taq酶溶液密封保存。

这样，Taq酶的活性和稳定性就得到了保证。

在需要使用Taq酶时，只需将其重新溶解即可，而且保持了原有的活性和稳定性，方便实验操作。

Taq酶冻干工艺在分子生物学领域有着广泛的应用。

首先，它是PCR技术的关键步骤之一，用于扩增目标DNA序列。

PCR技术在基因工程、医学诊断、疾病预防等方面具有重要的应用前景。

其次，Taq酶冻干工艺还可以应用于DNA测序、基因克隆、基因突变分析等领域。

这些应用都依赖于Taq酶的高效、稳定的活性。

与传统的酶保存方法相比，Taq酶冻干工艺具有明显的优势。

首先，冻干工艺可以将Taq酶保存在较长的时间内而不失活性，延长了其使用寿命。

其次，冻干Taq酶易于储存和运输，方便实验室的使用。

此外，冻干工艺还可以提高Taq酶的稳定性，减少不必要的损失。

因此，Taq酶冻干工艺在分子生物学研究中具有重要的应用价值。

Taq酶冻干工艺是一项重要的生物技术方法，通过冻干技术实现对Taq酶的高效、稳定的保存和利用。

其原理简单，步骤清晰，应用广泛，具有明显的优势。

Taq酶冻干工艺的发展为分子生物学领域的研究提供了有力的支持，为相关领域的进一步发展和应用提供了有力的技术支持。

taqdna聚合酶基因的克隆实验原理聚合酶是一种重要的酶，能够催化DNA双链解旋和合成RNA的过程。

在遗传工程和分子生物学研究中，对聚合酶基因的克隆实验具有重要意义。

一、聚合酶基因的克隆实验原理1.提取DNA：首先，需要从细胞中提取DNA。

这可以通过细胞裂解和蛋白酶处理、有机物或者无机盐提取法等多种方法来实现。

经过提取后，可以得到纯净的DNA溶液。

2. PCR扩增：在得到DNA样本后，可以利用聚合酶链式反应（PCR）技术对聚合酶基因进行扩增。

PCR技术利用聚合酶酶、引物和dNTPs等原料，通过多次循环的温度变化，将特定DNA片段迅速扩增成百万甚至亿万倍。

3.消化和连接：经过PCR扩增后，得到的DNA片段需要进行酶切消化和连接。

酶切消化是通过限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割，得到所需的DNA片段。

连接则是利用连接酶将所需的DNA片段连接到载体上自由末端的操作过程。

4.转化：连接好的质粒需要通过转化技术导入到宿主菌中，通常使用大肠杆菌等细菌作为宿主。

转化是将外源DNA导入到宿主细胞内，并使其稳定存在并得以复制。

5.筛选：经过转化后，需要对宿主菌进行相应的筛选，找到携带了聚合酶基因的阳性菌落。

通常利用抗生素筛选法或者标记基因法来选出目的菌株。

6.提取和纯化：最终需要对筛选出的阳性菌株进行DNA提取和纯化，得到纯净的含有聚合酶基因的质粒DNA。

通过以上步骤，可以成功得到聚合酶基因的克隆质粒，并可以进一步进行表达、纯化、功能验证等实验。

二、聚合酶基因的克隆实验应用1.遗传工程研究：利用聚合酶基因的克隆实验，可以获得大量的聚合酶基因，从而对其进行结构与功能的深入研究。

这对于揭示聚合酶在DNA复制、转录和修复等生物学过程中的作用具有重要意义。

2.分子生物学研究：在分子生物学研究中，聚合酶基因的克隆实验可以用于构建基因工程载体、进行基因表达调控、开展蛋白结构与功能研究等，为分子生物学研究提供了重要的工具和材料。

《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言随着生物科技的迅速发展，重组蛋白技术在生物学研究及实际应用中发挥着越来越重要的作用。

Taq DNA聚合酶作为分子生物学领域中常用的酶类，其活性直接影响到PCR（聚合酶链式反应）的效率和准确性。

因此，提高Taq DNA聚合酶的活性成为了一个重要的研究方向。

本文旨在探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料主要包括Taq DNA聚合酶基因、表达载体、宿主细胞以及相关的实验试剂。

2. 方法（1）基因克隆：首先，从已知的DNA序列中获取Taq DNA 聚合酶的基因序列，然后将其克隆到表达载体中。

（2）重组蛋白表达：将含有Taq DNA聚合酶基因的表达载体转入宿主细胞中，通过诱导表达获得重组Taq DNA聚合酶。

（3）酶活性检测：通过PCR反应检测重组Taq DNA聚合酶的活性，并与其天然酶活性进行比较。

（4）优化表达条件：通过改变表达条件（如温度、pH值、诱导剂浓度等），优化重组Taq DNA聚合酶的活性。

三、实验结果1. 重组Taq DNA聚合酶的表达通过基因克隆和重组蛋白表达，成功获得了重组Taq DNA聚合酶。

SDS-PAGE结果表明，重组Taq DNA聚合酶在宿主细胞中得到了有效表达。

2. 酶活性检测PCR反应结果显示，重组Taq DNA聚合酶具有较高的活性。

与天然Taq DNA聚合酶相比，重组Taq DNA聚合酶的活性得到了显著提高。

3. 优化表达条件通过改变表达条件，发现适当的温度、pH值和诱导剂浓度能够进一步提高重组Taq DNA聚合酶的活性。

其中，在37℃、pH 值为7.5的条件下，使用适量的诱导剂，能够获得最佳的酶活性。

四、讨论本研究利用重组蛋白技术成功提高了Taq DNA聚合酶的活性。

这为PCR反应的效率和准确性提供了有力保障，有助于推动分子生物学领域的发展。

此外，通过优化表达条件，可以进一步提高重组Taq DNA聚合酶的活性，为实际应用提供了更多可能性。

taqdna聚合酶的最佳反应温度
TAQ DNA聚合酶是一种从热泉菌中分离出来的酶，它具有高度的稳
定性和耐热性，在PCR技术中得到了广泛的应用。

TAQ DNA聚合酶
最佳反应温度是多少呢？这是一个非常重要的问题，因为它直接影响
到PCR反应的效率和准确性。

TAQ DNA聚合酶最佳反应温度是72℃。

这个温度是在实验室条件下
通过大量的实验确定出来的。

在这个温度下，TAQ DNA聚合酶能够
充分发挥其催化作用，使得PCR反应能够高效、准确地进行。

但是需要注意的是，TAQ DNA聚合酶不仅仅只能在72℃下发挥作用。

实际上，TAQ DNA聚合酶具有一定的耐热性，在60-80℃范围内都
可以发挥一定的催化作用。

但是在低于60℃或高于80℃时，TAQ DNA聚合酶就会失去活性。

此外，需要注意的是，在PCR反应中还需要加入适量的缓冲液、dNTPs、引物等试剂，并且需要控制好反应体系中的pH值、离子浓
度等因素，才能够保证PCR反应的高效、准确。

总之，TAQ DNA聚合酶最佳反应温度是72℃，在PCR反应中需要控制好反应体系中的各种因素，才能够保证PCR反应的高效、准确。

taqdna聚合酶名词解释
TAQ DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，广泛应用于分子生物学实验
中的PCR（聚合酶链反应）技术。

TAQ DNA聚合酶得名于其首次从热温泉中分离
出的一种细菌——热泉溶菌酶（Thermus aquaticus）。

该酶具有在高温下工作的能力，能够在反应温度高达94-96摄氏度的条件下保持稳定活性。

TAQ DNA聚合酶在PCR技术中起着关键作用。

PCR技术是一种用于扩增
DNA片段的方法，它通过不断重复DNA的变性、退火和延伸的步骤，使得特定的DNA片段得以快速扩增至数以亿计的拷贝数。

在PCR反应中，TAQ DNA聚合酶
被用来催化DNA的延伸步骤。

由于TAQ DNA聚合酶的热稳定性，它能够耐受高温引起的变性，因此在PCR
反应的高温变性步骤中不会失活。

此外，TAQ DNA聚合酶还具有5'→3' DNA依赖DNA聚合酶活性，可以在延伸步骤中合成新的DNA链。

TAQ DNA聚合酶的广泛应用使得PCR技术成为分子生物学研究中的重要工具。

它在基因检测、DNA测序、基因克隆等领域有着广泛的应用。

TAQ DNA聚合酶
的发现和应用为分子生物学研究的发展做出了巨大贡献。

Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 是耐热的DNA 聚合酶，具有5’-3’ DNA 聚合酶活性和双链DNA 特异的5’-3’外切核酸酶活性，无3’-5’外切酶活性。

使用该产品扩增得到的PCR 产物的3’末端附有一个“A ”碱基，可直接用于TA 克隆。

■产品说明PCR 、TA 克隆。

■应用范围用活性化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol 脱氧核苷酸摄入为酸不溶物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U ）。

■活性定义无核酸内切、外切酶活性，也无核酸污染，其酶纯度检测大于99％。

■品质保证产品内容Taq DNA Polymerase （5U/µl ）2+10×Taq Reaction Buffer （Mg plus ）10 mM dNTP 保存条件：-20 ℃. E coli 重组蛋白。

■来源20mM Tris-Cl (pH 8.0), 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5%Nonidet P-40, 0.5%Tween-20和50% 甘油。

■储存缓冲液10×Taq Reaction Buffer ：100mM Tris-Cl(pH8.3@25℃), 500mM KCl, 15mM MgCl 。

2■反应缓冲液GeneCopoeia Inc.19520 Amaranth DriveGermantown, Maryland 20874USATel: 301-515-6982; 1-866-360-9531Fax: 301-515-6983Web: 产品套装编号: C0101A , 本套装包含以下产品:产品编号C01010A C01011A C10010C包装规格200µl1.25ml ×20.5mlTaq DNA 聚合酶生产经销商:能基因广州复能基因有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D 区8楼 (邮编: 510663)技术热线: 020-******** 电子邮箱: support @ 网址:■基本反应条件体系：1、PCR 10× Reaction Buffer Primer1Primer210mM dNTP TemplateTaq DNA Polymerase ddH O22.5µl0.5µl1~100ng(质粒)10~1,000ng(基因组)0.2µl up to 25µl反应物组成体积终浓度l ×0.2~1µM 0.2~1µM0.2mM1U /Reaction条件：2、PCR 94℃94℃Tm -5℃72℃72℃4℃2 min 30 sec 30 sec 1kb/min 7 min hold30 cycles}1. PCR 反应条件应根据模板、目的片段大小、引物结构等具体条件不同，设定最佳反应条件。

taq聚合酶作用
Taq酶聚合酶最基本的作用是在PCR反应过程中扮演DNA聚合酶的角色,实现DNA链的扩增。

taq酶是一种具有热稳定性的DNA聚合酶，是从水生栖热菌中分离出来的，是让聚合酶链反应能够迅速发展而广泛应用的原因。

在循环的高温条件中仍然能够保持较高的活性，而且taq酶的催化活性对于镁离子浓度非常敏感。

绝大多数酶在经历高温之后会变性失活，但Taq酶可以耐受90摄氏度以上的高温。

通常如果是用taq酶进行聚合酶链反应的话，变性的温度往往在95摄氏度左右，这是taq酶在进行30个左右的聚合酶链反应之后，活力不会损失太多的最高耐受温度，而且taq酶在热变性是不会被钝化，也不需要在每一次扩增后，加新酶能够提高扩增片段特异性以及扩增效率，所以这样的话还能使聚合酶链反应技术简单化，也更加大大的降低了成本。

Taq酶的作用是让聚合酶链反应能够迅速发展和广泛应用的原因，Taq酶是一种具有热稳定性的DNA聚合酶，是从水生栖热菌中分离出来的，Taq酶在循环的高温条件中仍然能够保持较高的活性，而且taq酶的催化活性对于mg2+浓度非常敏感。

基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。

分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。

）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。

（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。

这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。

这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

基因工程复习题第一章1，基本概念：移动基因：（又叫跳跃基因或转座子）是染色体DNA上可复制和位移的一段DNA序列。

断裂基因：编码序列不连续的间断基因。

重叠基因：同一段DNA片段能够编码两种甚至多种蛋白质分子。

假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

重复序列：基因序列的多拷贝。

基因家族：由功能相关的基因成套组合形成。

哪些是真很和生物所特有的基因：断裂基因、假基因、重复序列。

基因工程（重组体DNA技术）：指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体结合成一个复制子，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，二能持续稳定的繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。

*3、基因工程的基本过程（步骤）。

切—接—转—增—检P16①目的基因制取②基因载体的选择与构建③目的基因与载体DNA的拼接④重组体分子导入受体细胞⑤外源基因的表达和产物的分离纯化第二章*寄主细胞控制的限制与修饰P20①宿主控制限制---核酸限制性内切酶②宿主控制修饰---修饰的甲基转移酶以λ(k) 噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

λ(k)感染B菌株↙↘大量的噬菌体少量的在被限制前发生甲基化DNA被限制↓传代甲基化链迅速增多↓限制被阻止↓少量具有B菌株修饰的λ(B)群体两种酶的作用：R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶——修饰一种是核酸内切限制酶——限制*2、核酸内切酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型酶的基本特性P22内切酶Ⅰ型①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM和Mg 2+辅助因子③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成④有特定的识别位点⑤切割方式：切割的核苷酸顺序无专一性内切酶Ⅱ型①有内切酶活性和甲基化酶活性——分开反应②能识别专一的核苷酸序列，并在固定位置上切割③识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构④切割可形成两种核苷酸切割末端————粘性末端和平末端内切酶Ⅲ型①由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有内切酶活性和甲基化酶活性②需Mg 2+、ATP、SAM辅助因子③可识别特定碱基顺序，且它的切割位点也是没有特异性的3、基本概念：粘性末端：指DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能通过互补碱基间配对而重新环化起来。

TaqDNA聚合酶科技名词定义中文名称：TaqDNA聚合酶英文名称：Taq DNA polymerase定义：编号：EC 2.7.7.7。

存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。

该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。

这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。

目录Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真细菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。

该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min 和5～6min后，仍可保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.TaqDNA 聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA 为模板，dNTP 的浓度为0.7～0.8mmol/L 时，用不同浓度Mg2+进行 PCR 反应10min ，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L 时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA 聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L 时可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP 结合而影响PCR 反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP 总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL 能使Taq DNA 聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L ，高于75mmol/L 时明显抑制该酶 的活性.该酶无校对活性，易产生错配碱基。

《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言DNA聚合酶是分子生物学领域中至关重要的酶类，其中Taq DNA聚合酶因其高效、耐热等特性，在PCR（聚合酶链式反应）技术中得到了广泛应用。

然而，天然Taq DNA聚合酶的活性往往受到多种因素的限制，如温度、pH值、酶浓度等。

为了提高其活性并拓宽应用范围，本研究利用重组蛋白技术对Taq DNA聚合酶进行改造，以期提高其活性及稳定性。

二、材料与方法1. 材料准备本研究所用的材料包括：Taq DNA聚合酶基因、表达载体、宿主菌、各种试剂及实验器材。

所有材料均经过严格的质量控制，确保实验的准确性和可靠性。

2. 方法（1）基因克隆与表达：通过PCR技术扩增Taq DNA聚合酶基因，将其克隆至表达载体中，转化至宿主菌中进行表达。

（2）重组蛋白的纯化：采用亲和层析法对表达得到的重组蛋白进行纯化，得到纯度较高的Taq DNA聚合酶。

（3）酶活性测定：通过PCR实验，测定不同温度、pH值、酶浓度下的Taq DNA聚合酶活性，分析其最佳反应条件。

（4）酶活性比较：将改造后的Taq DNA聚合酶与天然Taq DNA聚合酶进行活性比较，评估重组蛋白技术对酶活性的提高程度。

三、实验结果1. 重组蛋白的表达与纯化通过基因克隆与表达，成功获得了重组Taq DNA聚合酶。

经过亲和层析法纯化，得到纯度较高的重组蛋白。

如图1所示，SDS-PAGE电泳结果显示，重组蛋白的纯度较高，无明显杂带。

图1：SDS-PAGE电泳结果图2. 酶活性测定与比较通过PCR实验，测定不同温度、pH值、酶浓度下的Taq DNA聚合酶活性。

结果表明，在最佳反应条件下，重组Taq DNA聚合酶的活性明显高于天然Taq DNA聚合酶。

如图2所示，在95℃下反应时，重组Taq DNA聚合酶的活性提高了约30%。

同时，在pH值为8.5的条件下，其活性也得到了显著提高。

此外，在较低的酶浓度下，重组Taq DNA聚合酶也表现出较高的活性。

快速纯化高活力基因工程T aq DNA聚合酶摘要:用含有Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化 E.coli DH5α菌株,IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶.利用该酶的热稳定性,经两轮-70℃深度冷冻和75℃水浴,细菌裂解释放内容物,以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化Taq DNA聚合酶的目的.PCR扩增反应表明所制备的Taq DNA聚合酶的活力、敏感性、特异性均达到试验要求.该方法具有快速简便的优点.关键词:Taq DNA聚合酶;冻融;纯化;聚合酶链式反应1958年科学家分离出DNA聚合酶后,就曾设想利用DNA聚合酶扩增产生大量DNA.1983年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)[1].但一般DNA聚合酶不耐高温,每一轮聚合反应完成后,都需加入新的聚合酶,这使操作既浪费时间又易出错.1986年Erlich分离纯化出热稳定的适用于PCR技术的Taq DNA聚合酶.Taq DNA聚合酶是一种耐热的单亚基酶(Mr =94000),具有5′→3′聚合酶的活性,在核苷酸掺入过程中,根据目的序列的不同,最适反应温度为75 ~ 80℃,最初是从耐热细菌Thermus aquaticus中纯化而得[2],现已有其基因工程酶[3].它很高的最适反应温度可消除DNA二级结构,有利于聚合反应顺利进行.基因工程Taq DNA聚合酶表达载体的构建便利了该酶的纯化.但从细菌培养物纯化酶的方法仍很繁琐,需要进行选择性沉淀和离子交换色谱分离[4,5]. Edith.G(1995)[5]利用Taq聚合酶的热稳定性,提出冻融法去除杂蛋白等大分子,所制备的酶可用于PCR和测序反应[5],但纯化中需要使用挥发性神经剧毒物质PMSF,且在长时间透析过程中部分酶的活力会丧失.在综合考虑Taq DNA聚合酶分子结构和PCR反应体系基础上,我们对所用试剂进行优化,不必使用融菌酶和剧毒物质PMSF,大大简化了纯化该酶的工艺,整个纯化过程仅用-70℃、75℃交替冻融和离心就纯化出产量、敏感性、特异性和活力均很高的Taq DNA聚合酶.1实验材料1.1宿主菌和聚合酶表达载体.宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株;重组表达载体为pTaq表达质粒.插入原核表达质粒的TaqDNA聚合酶基因的转录由tac启动子控制.以pTaq转化E.coliDH5α菌株,获得转化子.1.2试剂(1)Taq DNA聚合酶纯化缓冲液A:50mM葡萄糖,50 mM Tris.HCl(PH 7.9) , 1mMEDTA;(2)Taq DNA聚合酶纯化缓冲液B:10 mM Tris.HCl (PH 7.9) ,100 mM NaCl ,1mMEDTA ,0.5% Tween 20,0.5% Nonidet-P40,1mM DTT;(3)LB (Lauria Bertaini )液体培养基、0.5×TBE缓冲液参照《分子克隆》[7].所用生化试剂购于Promega公司.1.3Taq DNA聚合酶的表达与纯化(1)以插入Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coliDH5α菌株,具体方法见《基因工程操作技术[6]; (2)取一个已转化的DH5α克隆于5ml LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素),37℃200rpm振荡过夜;(3)1ml过夜培养液接种200ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素),37℃200rpm振荡4小时后加入IPTG(终浓度5mM)诱导聚合酶基因表达.继续培养10小时;(4)离心收集菌体;(5)以Buffer A清洗菌体二次,悬浮于8mlBuffer A ,反复二次-70℃、75℃交替冻融;(6)12000 g 离心20分钟,取上清;(7)上清液中加入等体积的Buffer B ,75℃水浴30分钟;(8)12000 g离心20分钟;(9)取上清液,加入等体积甘油,-20℃保存备用.1.4PCR反应检测Taq DNA聚合酶活力PCR扩增反应检查所纯化Taq DNA聚合酶活力.上海Sangno生物工程公司的商品酶为对照.随机挑取水稻cDNA文库7个克隆,抽提质粒为摸板;M13通用引物.PCR反应体系(50μl)为:摸板10μl(1ml LB培养物所抽提的质粒量的1/400),10×PCR缓冲液5μl,25mMMgCl23.5μl ,25μg/mlM13-Reverse引物1μl,25μg/ml M13-Forward引物1μl,20mM dNTP0.5μl ,自制Taq DNA聚合酶1μl ,对照组使用1个单位聚合酶.所用试剂和引物购于上海Sangno生物工程公司.图1所纯化Taq DNA聚合酶与商品酶PCR扩增结果PCR反应参数:94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,57℃退火45秒,72℃延伸90秒,40个循环.PCR反应后取7μl产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测.2结果与讨论以冻融法从200mlE.coli培养物中制备到15ml聚合酶溶液.加入等体积灭菌甘油后,PCR扩增水稻cDNA文库7个随机克隆的结果见图1.图1中上面一排1~7泳道为使用自制Taq DNA聚合酶的PCR扩增结果;下方一排是对照组,为使用商品酶对相应克隆进行PCR扩增的结果.使用自制酶,可将7个cDNA片段全部扩增出,其敏感性和特异性等同于商品酶.根据电泳结果,可以看出所纯化的Taq DNA聚合酶的活力超过1U/μl ,按此得率,每升细菌培养物中可纯化出超过15万单位的酶.影响Taq DNA聚合酶产量的主要因素是宿主菌株和IPTG诱导时间[4,5].使用更优良的宿主菌和相应的最佳诱导时间,可望进一步提高Taq DNA聚合酶产量.曾对所制备Taq DNA聚合酶以SDS-PAGE分析,发现所制备的蛋白分子量约为94Kda,与Taq DNA聚合酶的分子量相符,且纯度很高.一般来说,以经典方法分离纯化活性蛋白的工艺相当繁琐,多步骤、长时间的分离纯化不但直接提高了产品的成本,而且不利于酶的得率和活力.Taq DNA聚合酶具有很高的热稳定性,作用温度范围在20℃~ 85℃,在92.5℃下其活性半衰期为130分钟,所以-70℃低温冷冻和75℃高温处理对该酶的活力影响都不大;而普通E.coli菌体蛋白不具有忍受低温和高温处理的能力,在-70℃深度冷冻续以75℃融解后,细菌胞膜就会破裂而释放菌体蛋白.除了Taq DNA聚合酶,其他蛋白质在75℃水浴条件下会变性而DNA大分子缠绕,再经离心就可直接去除杂质而达到分离纯化酶的目的.目前Taq DNA聚合酶的最低商品价格为0.2~0.3元/单位,所以使用自制酶不仅可以取得很好的试验结果,而且还节省大量的科研经费.浙江大学生物技术研究所在使用所制Taq DNA聚合酶对水稻的6000个独立基因分别以T3,T7和M13-R,M13-F为引物进行了逾万次PCR扩增时,阴性对照组结果正常;并将产物点制成cDNA基因芯片,经中科院微生物所和中国农科院水稻研究所使用反映良好.。

《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言随着生物科技的迅速发展，重组蛋白技术已成为生物医学研究领域中的一项重要技术。

在分子生物学和遗传工程中，Taq DNA聚合酶作为一种关键酶类，广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）技术中。

然而，Taq DNA聚合酶的活性往往受到多种因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。

因此，如何提高Taq DNA 聚合酶的活性成为了研究的热点。

本文旨在探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的方法及效果。

二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括Taq DNA聚合酶基因、表达载体、宿主细胞、PCR仪、离心机、分光光度计等。

2. 方法（1）基因克隆：将Taq DNA聚合酶基因克隆至表达载体中，构建重组质粒。

（2）蛋白表达：将重组质粒转入宿主细胞中，诱导表达Taq DNA聚合酶。

（3）蛋白纯化：通过一系列的纯化步骤，如离子交换层析、凝胶过滤等，获得纯化的Taq DNA聚合酶。

（4）酶活性检测：利用PCR技术，检测纯化后的Taq DNA 聚合酶的活性。

三、实验结果1. 基因克隆与蛋白表达通过基因克隆技术，成功将Taq DNA聚合酶基因克隆至表达载体中，并转入宿主细胞中。

在适当的诱导条件下，成功表达了Taq DNA聚合酶。

2. 蛋白纯化经过一系列的纯化步骤，成功获得了高纯度的Taq DNA聚合酶。

纯化后的Taq DNA聚合酶在分光光度计下呈现出单一且清晰的吸收峰，表明其纯度较高。

3. 酶活性检测通过PCR技术检测纯化后的Taq DNA聚合酶的活性，发现利用重组蛋白技术获得的Taq DNA聚合酶活性得到了显著提高。

与野生型Taq DNA聚合酶相比，其PCR扩增效率更高，产物产量更大。

四、讨论本实验利用重组蛋白技术成功提高了Taq DNA聚合酶的活性。

这主要得益于基因的优化表达、蛋白的纯化以及酶的活性检测等多个环节的优化。

首先，通过基因克隆技术，我们获得了高效表达的Taq DNA聚合酶基因；其次，在蛋白纯化过程中，我们采用了一系列高效的纯化方法，如离子交换层析、凝胶过滤等，有效地去除了杂质，提高了酶的纯度；最后，通过PCR技术检测酶活性，我们发现重组蛋白技术获得的Taq DNA聚合酶具有更高的活性。

高中生物《基因工程》专题过关检测一、单项选择题1.为提高转基因抗虫棉的抗虫持久性,可采取基因策略(包括提高杀虫基因的表达量、向棉花中转入多种杀虫基因等)。

例如,早期种植的抗虫棉只转入了一种Bt毒蛋白基因,抗虫机制比较单一,现在经常将两种或两种以上Bt基因同时转入棉花。

关于上述基因策略,下列叙述错误的是( )A.提高Bt基因的表达量,可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度B.转入棉花植株的两种Bt基因的遗传不一定遵循基因的自由组合定律C.若两种Bt基因插入同一个T-DNA并转入棉花植株,则两种基因互为等位基因D.转入多种Bt基因能提高抗虫持久性,是因为棉铃虫基因突变频率低且不定向答案 C2.T4溶菌酶来源于T4噬菌体,是重要的工业用酶。

科学家通过一定技术使T4溶菌酶的第3个异亮氨酸变为半胱氨酸(异亮氨酸的密码子是AUU、AUC、AUA,半胱氨酸的密码子是UGU、UGC),于是在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键,从而使T4溶菌酶的耐热性得到了提高。

下列叙述正确的是( )A.对T4溶菌酶的改造属于发酵工程的范畴B.参与新的T4溶菌酶合成的tRNA种类一定会发生改变C.改造后的T4溶菌酶中的二硫键的作用类似于DNA中的氢键D.上述改造通过替换T4溶菌酶DNA上的1个碱基对即可实现答案 C3.限制性内切核酸酶SalⅠ和XhoⅠ识别序列与切割位点如图1。

用SalⅠ切割目的基因两侧,用XhoⅠ切割普通质粒,再用DNA连接酶处理可形成重组质粒。

实验者用2种酶单独切割或同时切割普通质粒和重组质粒,再将产物电泳分离,其结果如图2。

下列叙述正确的是( )图1图2A.SalⅠ切割产生的黏性末端与XhoⅠ切割产生的黏性末端不同B.根据重组质粒的酶切结果可知重组质粒中有2个目的基因C.重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhoⅠ的识别序列D.2种酶切后产生的2 kb产物可作为探针筛选含目的基因的受体细胞答案 C4.下列对DNA相关实验的叙述,错误的是( )A.可利用DNA不溶于酒精的特点来提取DNAB.可利用洋葱研磨液离心后的沉淀物来提取DNAC.PCR中通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合D.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时,需将核酸染料加入琼脂糖溶液中答案 B5.PCR又称聚合酶链式反应,在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。

《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言随着分子生物学和遗传学的快速发展，DNA聚合酶在生物技术和生物医学领域的应用日益广泛。

Taq DNA聚合酶作为一种常用的DNA复制工具酶，其活性及性能的优化对生物技术研究和应用具有重大意义。

本文将探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA 聚合酶活性的研究，以期为相关领域的研究和应用提供新的思路和方法。

二、Taq DNA聚合酶概述Taq DNA聚合酶是一种从嗜热菌Thermus aquaticus中提取的热稳定DNA聚合酶，因其具有良好的热稳定性、快速反应速度和高活性等特点，在PCR（聚合酶链式反应）等分子生物学实验中得到了广泛应用。

然而，天然Taq DNA聚合酶的活性在某些特定条件下仍存在不足，限制了其应用范围。

因此，如何提高Taq DNA聚合酶的活性成为了研究的热点。

三、重组蛋白技术及其在提高Taq DNA聚合酶活性中的应用重组蛋白技术是一种通过基因工程手段，将目的基因在体外进行克隆、表达和纯化，以获得具有特定功能或性质的蛋白质的技术。

在提高Taq DNA聚合酶活性方面，重组蛋白技术的应用主要体现在以下几个方面：1. 基因克隆与表达：通过基因工程手段，将Taq DNA聚合酶基因进行改造和优化，以提高其表达水平和活性。

例如，可以通过突变技术改变酶的某些氨基酸序列，从而提高其热稳定性或催化效率。

2. 蛋白质纯化与优化：利用重组蛋白技术，可以在体外大量表达Taq DNA聚合酶，并通过一系列纯化步骤获得高纯度的酶。

此外，还可以通过优化表达条件，如改变培养基成分、调整温度和pH值等，进一步提高酶的纯度和活性。

3. 酶分子改造：通过蛋白质工程和计算机模拟等技术，对Taq DNA聚合酶的分子结构进行改造，以获得具有更高活性和更佳性能的突变体。

例如，可以改变酶的底物结合位点或催化机制，以提高其催化效率和特异性。

四、实验方法与结果本研究采用重组蛋白技术对Taq DNA聚合酶进行改造和优化。

taq dna的聚合酶酶促反应最不适的温度摘要：一、引言二、taq 聚合酶简介三、taq 聚合酶酶促反应最不适的温度四、影响taq 聚合酶活性的因素五、实验方法和步骤六、结论正文：一、引言在分子生物学实验中，Taq DNA 聚合酶的应用十分广泛，特别是在PCR 反应中。

了解Taq 聚合酶的最不适温度对于实验条件的优化具有重要意义。

本文将探讨Taq 聚合酶酶促反应最不适的温度，以及影响其活性的因素。

二、taq 聚合酶简介Taq 聚合酶来源于一种名为Thermus aquaticus 的热泉细菌，可以在高温下保持稳定性和活性。

在PCR 反应中，Taq 聚合酶负责在模板DNA 链的引导下合成新的DNA 链。

其具有高度的热稳定性、忠实性和效率，使其成为PCR 反应的理想选择。

三、taq 聚合酶酶促反应最不适的温度Taq 聚合酶的最不适温度是指在该温度下，酶的活性受到最大程度的抑制。

一般而言，Taq 聚合酶的最不适温度在75-80℃左右，低于此温度，酶活性逐渐降低，可能导致PCR 反应失败。

四、影响taq 聚合酶活性的因素1.温度：如上所述，温度对Taq 聚合酶活性有很大影响。

适当的温度可以保证酶的稳定性和活性。

2.pH 值：Taq 聚合酶的最适pH 值约为7.5-8.0，偏离此范围可能导致酶活性降低。

3.盐浓度：适当的盐浓度可以提高酶的稳定性和活性。

通常在PCR 反应中，使用含有氯化镁的缓冲液来提高Taq 聚合酶的活性。

4.底物：Taq 聚合酶需要合适的底物才能发挥活性，如dNTPs（去氧核苷酸三磷酸盐）。

5.抑制剂：某些化合物如EDTA、DMSO 等可以抑制Taq 聚合酶的活性，应注意避免使用。

五、实验方法和步骤1.准备含有Taq 聚合酶的PCR 反应体系。

2.将反应体系在不同温度下进行酶促反应。

3.监测反应产物的生成情况，以确定最不适温度。

4.分析实验结果，得出Taq 聚合酶最不适温度。

六、结论了解Taq 聚合酶的最不适温度有助于优化实验条件，提高实验成功率。