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细胞内〔Ca^(2+)〕_i改变与糖尿病慢性并发症
沈飒
【期刊名称】《国外医学：内分泌学分册》
【年(卷),期】1999(19)1
【摘要】综述糖尿病时，不同组织细胞内〔Ｃａ２＋〕ｉ浓度的改变，并讨论其可能机制及其与糖尿病并发症或合并症的关系。
【总页数】4页(P16-19)
【关键词】糖尿病;细胞内[Ca^2+]1;并发症
【作者】沈飒
【作者单位】上海第二医科大学附属新华医院
【正文语种】中文
【中图分类】R587.102
【相关文献】
1.细胞内[Ca2＋]1改变与糖尿病慢性并发症 [J], 沈飒
2.牛磺酸对血管紧张素Ⅱ改变培养心肌细胞内游离Ca^(2+)浓度作用的影响 [J], 葛慧;陶亮;刘培庆;马静;凌文华
3.二次脑损伤神经细胞内游离Ca^(2+)、脑组织丙二醛与血液流变性的改变 [J], 费舟;章翔;王晓峰;卢佩林;刘先珍
4.慢性冬眠心肌细胞内Ca^(2+)及Mg^(2+)含量测定 [J], 季晓平;张运;邢艳秋;张园园;王勇;郑昭伦;李心河
5.用Fluo3-AM测定2型糖尿病患者淋巴细胞内Ca^(2+)浓度及药物对患者胞内Ca^(2+)浓度的影响 [J], 章立;李新荣;徐蘅;张鉴棠
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用荧光测定法，通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。
根据激发光的波长不同，可以将检测细胞内钙离子用的荧光染料分为紫外光激发的钙离子荧光指示剂和可见光激发的钙离子荧光指示剂。
其中，紫外光激发的钙离子荧光指示剂有Fura 2、lndo-1、Bis-fura、Ouin-2、Fura-4 F、Fura-5F、Fura-6F、Benzothiaza-1、Benzoth．Iaza-2、BTC等；可见光激发的钙离子荧光指示剂有FIno-3、Fluo-4、Fluo-5N、Rhod-5N、X-rhod-5N 、Calcium Green-1 、Calcium Green-2、Calcium Orange、Calcium Crimson、Fura Red等。
Fluo-3具有Kd值较高、可见光激发、监测背景低等优点，被广泛用于荧光监测的指示剂[9]。
Fluo-3/AM在与钙结合后表现为荧光强度的增加，细胞内钙离子浓度愈高，荧光愈强，细胞内钙离子浓度愈低，荧光愈弱[10]。
以往测定细胞内钙离子浓度变化的方法通常是利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来完成，但缺点是LSCM扫描采集速度慢，对培养器皿要求特殊，且价格高昂，检测成本高，对细胞伤害大。
为降低长时间采集对样品造成的损伤，作者应用高灵敏度的流式细胞仪和流式细胞技术相结合，以纯化的T淋巴细胞为研究对象，选择Fluo-3/AM负载细胞，成功获得了实时监测并分析受到外界信号刺激时细胞内Ca2+浓度的动态变化。
结果显示随着刺激信号的加入和时间的变化，Fluo-3/AM负载的T淋巴细胞内的钙离子浓度呈现动态变化。
该方法能简单快速、可直接动态实时检测细胞内钙离子荧光信号，为研究细胞内的Ca2+浓度的动态变化提供了实用的解决方案和方法。
水母发光蛋白（ＡＥＱ）广泛应用于Ｃａ２＋信号监测领域己有近４０年。
ＡＥＱ是由一个２２ＫＤａ大小的可结合Ｃａ２＋的脱辅基发光蛋白和辅基腔肠素（ＣＴＺ）组成的，在有氧情况下，自发组成功能全蛋白，具有三个Ｃａ２＋结合手性位点。
细胞内钙离子的检测方法包括荧光探针法、放射性同位素示踪法、电极法等。
下面我将结合以上方法给出详细的说明：
1. 荧光探针法：这是一种应用广泛的细胞内离子检测方法，主要应用于钙离子检测。
钙离子荧光探针如BCECF、Fluo-3、Fura-2等可以嵌入细胞，特异性地与细胞内的钙离子结合，从而改变其荧光特性。
例如，当钙离子结合到Fluo-3等染料上时，染料的吸收和发射光谱会发生变化，使其在细胞内的钙离子浓度变化时可以被仪器检测到。
这种方法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也有一定的局限性，如细胞内钙离子浓度变化时可能伴随其他离子浓度的变化，导致结果复杂。
2. 放射性同位素示踪法：这种方法需要使用放射性标记的物质，如Ca45，将其引入细胞内，通过放射自显影技术检测细胞内钙离子的变化。
这种方法操作相对复杂，且有一定的放射性污染风险，因此较少使用。
3. 电极法：这是一种通过在细胞内放置一个微电极，该电极可以测量钙离子的电化学变化。
这种方法主要用于体外实验，如组织块或单个细胞的钙离子测定。
在实际操作中，荧光探针法更为常用，因为其灵敏度高、操作简便。
然而，任何一种方法都有其局限性，需要在实验设计和实际操作中根据具体情况进行选择和调整。
以上就是细胞内钙离子检测的一些常见方法，希望能对你有所帮助。
细胞内钙信号Ca2+信号（Ca2+signals）调控着细胞内许多重要的功能，包括短期效应如细胞电兴奋、收缩和分泌功能；长期效应如细胞转录、增殖和分化以及死亡。
一、Ca2+在人体内的含量及分布99% 存在于骨骼和牙齿分布于血浆和组织细胞内的钙不到人体钙的1%细胞外：游离Ca2+浓度约1~2mmol/L细胞内：细胞核 50 ％线粒体 30 ％，浓度为0.6 mmol／L内质网 14 ％，约0.28 mmoI／L质膜(外层)占5 ％，约0.1 mmol／L胞浆Ca2+浓度：细胞在静止(非激活)状态时，细胞溶质中仅占总钙的0．5 ％(结合态)或0．005 ％(离子态)。
胞浆游离Ca2+浓度约0．1 μmo1/L，不但远低于细胞外液，而且低于肌浆网和线粒体内的Ca2+浓度。
随着细胞的活动，胞浆Ca2+浓度会发生变化。
例如，心肌细胞胞浆游离Ca2+浓度随心动周期在0.1～10µmol/L的范围内变动，这是心肌舒缩活动的基础。
血管平滑肌内Ca2+浓度的改变也为血管舒缩所必须。
内分泌细胞的分泌活动也伴随有细胞内钙的变化。
另外，在许多病理生理状态下，细胞内钙水平大大增加，引起细胞功能的改变，甚至导致细胞死亡。
因此认为细胞内Ca2+稳态失控是许多外界因素引起细胞坏死的共同机理，因此细胞溶质Ca2+处于极为严格的调节控制之中。
二、钙信号的来源有两条途径：细胞外Ca2+内流和细胞内钙库钙的释放。
（一）细胞外Ca2+内流研究发现，细胞膜上有三种主要的钙进入通道，即电压依赖性钙通道（VOCs）、受体门控性钙通道（ROCs）和储存开启性钙通道（SOCs）三个通道，其力学特征显著不同。
VOCs和ROCs常产生短暂、高强度的Ca2+内流，对VOCs和ROCs的开放机制已比较清楚。
而SOCs则产生持续的、较小Ca2+内流。
SOCs的开放由储存钙的充盈状态决定。
当储存钙排空时，细胞膜上的SOCs开放，Ca2+进入；反之关闭。
史娟等：细胞内钙成像和钙测定的基本原理及应用４５９Ｆｉｇ．２ＳｃｈｅｍａｔｉｃｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｍｅｌｅｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒａｒＩｄｉｔｓＣａ２＋一ｉｍａｇｉｎｇｐｒｉｎｃｉｐｌｅ（ｃｈａｎｇｅｄｆｂｍＭｉｙａｗａｋｉ８１１９）子结合，ｃａＭ会发生构象变化，其两端的“球形结构”向中间靠拢，以Ｍ１３为纽带，ＹＦＰ和ＣＦＰ间的距离缩小而发生荧光共振能量转移。
这样，当用４４０ｎｍ波长的蓝光激发时，ｃＦＰ４８０ｎｍ的青色荧光减弱而ＹＦＰ５３０ｎｍ的黄色荧光增强，利用Ｆ。
，，／Ｆ。
，，便可以间接衡量细胞内钙信号的变化。
荧光蛋白指示剂与发光蛋白和化学染料相比有其优越性。
与发光蛋白相比，属于比值测定，且荧光信号强，对光子监测系统要求低。
与化学荧光剂比较，可以微注射或异源表达测钙，染料的靶向定位好，可以测量特定的细胞器内的钙信号，而且无渗漏现象。
但它也有缺点，如信号的动力域窄（Ｒ…／ＲⅢｍ＜２），对ｐＨ值变化敏感等四’２…。
２．钙指示剂的负载指示剂只有成功地进入细胞，才有可能对钙信号进行监控。
负载指示剂的方法很多，在此介绍三种常用的方法。
２．１酯质载入商品化的酯质染料带有乙酰甲酯（ＡＭ）尾，具有疏水性可以被动地扩散至细胞内。
ＡＭ染料对钙离子没有亲和性，经细胞内的酯酶水解脱掉ＡＭ尾后才可以发挥指示剂的作用。
水解后的酸式染料为亲水性，不能扩散出细胞膜。
所以，染料最终可以不可逆地在细胞内达到很高的水平。
酯质染料的孵育条件因染料种类，细胞类型而有所不同。
以Ｆｕｒａ２ＡＭ为例，对于培养细胞和急性分离的细胞，一般ｌ～５¨ｍｏＬ／Ｌ浓度室温孵育３０ｍｉｎ，可以达到较好的负载效果。
在孵育的过程中，可以使用ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７或ｃｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ等助扩散剂，可以帮助疏水性的酯质染料均匀地扩散在细胞外液中，提高负载效果旧“。
脂质载人的优点是操作简便易行，不需要专门的技术要求，而且能在较短的时间内获得很高的染料浓度。
Pluronic F-127 (F127)美国Molecular Probes Inc.产品。
Ultima型共聚焦激光扫描显微镜为美国MERIDIAN Instruments Inc 产品。
1. 光源：Ultima型50Mw UV,200Mw Visible2. 激发波长：351-364nm，488nm，514nm3. 扫描系统：Ultima为台阶扫描，精度0.1um目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2┼]i为0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为1.2-1.3mmol/L,相差达10000倍。
胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。
显而易见,测定[Ca2┼]i在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。
Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。
荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。
100ug Fluo-3/AM 溶于100ul DMSO中，就是1ug/ul,1mg/ml,1g/L方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1mmol/L(1g/L)原液,-20oC避光保存。
F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。
用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10umol/L，并加入0.1％的Pluronic F-127备用。
2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10umol/L 染料液1ml，置于37oC的CO2孵箱里避光温育30min。
3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1mlDMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。
4.启动LSCM，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30sec）、扫描次数（300次），开始扫描。
5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。
但优于Fura-2/AM 的是，Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。
图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。
Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。
具体过程如下：1 Ca2+荧光探针负载1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i1.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。
测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
2.取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
3.将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
4.测定最大荧光比值(R max)和最小荧光比值(R min)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为R max；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为R min。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i1.对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光强度及分布变化，拍照。
2.对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。
激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。
细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线，再转换为时间~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。
为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = K d[(R-R min)/(R max-R)](F min/F max)其中，K d为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；R max、R min分别为上述测定的最大和最小荧光比值；F min、F max 分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。
实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i = K d[(F-F min)/(F max-F)]其中，K d为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，F max、F min分别为加0. 程如下：1 Ca2+荧光探针负载1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i5.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。
测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
6.取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。
7.将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。
8.测定最大荧光比值(R max)和最小荧光比值(R min)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为R max；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为R min。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i3.对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光强度及分布变化，拍照。
4.对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。
