详细版实验一--质粒DNA的提取.ppt

格式：ppt
大小：1.39 MB
文档页数：27

下载文档原格式

实验一质粒DNA的提取(共27张PPT)

应该出现白色絮状沉淀。
6. 12,000rpm离心10 分钟。
如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。
7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心 30-60秒，并弃去接液管内液体。
8. 向吸附柱CP3 内加600 l漂洗液PW ，12,000rpm 离心30-60 秒，并
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。
放回收集管中。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。
溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；
5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l ）。
L质B粒固是体2一培.种养将细基菌（1染1L-色）2体m外的l、过具有夜自主培复制养能力的的、共细价闭菌合环菌状超液螺旋加结构入的小1型.D5NmA分l子离。心管中，12,000rpm离
当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时, 在高盐浓度的情况下，染色1k体b到DN20A0之kb间交联形成不溶性>网4状00结0k构b并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、 RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。
在质粒提取中，质粒DNA与染色体DNA分离的主要依据是什么?

质粒DNA提取鉴定PPT课件

5 ul
sample
5ul
BamH Ⅰ 1 ul
HindⅢ
1 ul
HindⅢ
1 ul
10×buffer 2.5 ul ul
10×buffer 2.5
ddH2O
15.5 ul
ddH2O
第35页/共43页
DNA浓度测定溴乙锭荧光法(半定量法，一大组/板)
（1）制备1 %琼脂糖凝胶（塑料平皿中）凝固待用。
3 M醋酸钾：SDS十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了
十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate， PDS），而PDS是不溶的，溶液III加入使钾离子置换了 SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，SDS结合了大量蛋白质，PDS就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，
↓ -20℃ 30 min
第28页/共43页
酚/氯仿/异丙醇
酚：蛋白质的变性作用远大于氯仿，可最大程度将蛋白质抽提掉，但是在高浓度的盐溶液中，离心后酚会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；
我们单独用酚抽提酚，会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
第29页/共43页
也可用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
加入2.5倍体积的乙醇，-20放置，离心就可以将质粒DNA沉淀出来。

质粒提取实验PPT(完整版)

质粒检测：
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。
吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于之间，说明质粒质量较好，，低于1.8说明有蛋白质污染，大于 1.8说明有RNA污染。
Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别
质粒提取实验
பைடு நூலகம்
一实验目的
掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
二实验原理
质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的 DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链 DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。
顺序的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别
DNA在琼脂糖顺凝序胶中的泳动双时有侧电荷末效应端和D分子N筛A效应双。链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需
Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。
要或可的称被M 酶质为相切g粒2回应片D+N文限断激A结制。活通构性，常。内大都切部具酶分有切Ⅱ一出型个相酶或应所多数识个量别限的的制切序性口列内，具切从有酶而反酶产向切生对识相称别应的序数结列量构，，本接3质取ⅡD4培4凝线5加凝58有(在 8了由54观Ⅱ000℃ ℃ 说说 ℃7DN实含粒菌型养胶状入胶的一解于察型0000NA，明明000C，，验质是液限细板 D3板在定限糖和限A分rrr，50有有pppN11m采粒一入制菌的的识的制-拍制子mmm00磷001A蛋蛋0ua009、、、用的种的性使制制别电性照性的（0L酸k000白白溶e离离离的单染d内质备备顺场内—内rr00l迁骨c/pro质质rrm液Dmpp心心心3菌色切粒序强切切E—移r——架fimmNμ污污cn管振I555落体酶扩的度酶酶2I速loA离——在，，Immm染染5加（R中荡）于外需增双下作需度4心小小结离iii离Ⅰ，，nnn入轻n培能要侧，用要2与，，，m5心心构心心和大大m1轻养m够末的MDM紫相弃弃弃0加加上11lH于于混iNμ过ggLn00稳端原外对上上上i入入l的22nABmm，水11匀夜++d定理D灯分分清清清..ii22A重弃nn的激激与）N－－m遗、，，下子子，，，复A上识活活4，p33传特取取观μ质双的收收收性+μμ清别，，冰l溴ll液的点77察量链这集集集EE质（序大大00上BB酚体因和的产种菌菌菌00，用列部部，，静μμ兰培子酶对生迁体体体LL相软和分分摇摇置（（混养，切数粘移同纸酶ⅡⅡ匀匀5注注匀基具质值性速m数将切型型（（不不)中有粒i成末度n量管位酶酶污污质要要双D反端，的内点所所染染N粒吸吸链比。亦双A乙分识识EED到到共关即的BB链醇别N别别沉沉吸吸价系电试AD吸为的的淀淀头头复闭N，泳验干序序A物物，，性环可的方几）列列））不不结以迁法乎即具具上上宜宜构近移具可有有清清再再的似率有。反反到到回回D用，等向向N一一收收于取量A对对新新使使估决分的称称管管用用算于子净的的））分核。电结结子酸荷构构的分，，，大子因或或小本此称称。身它为为的们回回大能文文小以结结和同构构构样。。型的。速度向正电极方向迁移。本实验采用的EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位点分别为在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方

实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx

学海无涯
实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分质粒DNA 的提取
一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器恒温摇床、台式离心机 2、试剂溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因

质粒DNA提取 PPT

P1
2
使用移液器或涡旋振荡
器重悬
加入P1前检查是否已加入RNase A和TIANRed。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
TIANRed试剂的加入对于后续PCR、酶切和测序都没有影响。使用时按照TIANRed:溶液 P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加入到收集好的菌体中彻底混匀，由于菌体的存在，混匀后的溶液为浑浊的红色。
质粒DNA提取
目录
一质粒基础知识二质粒的构建及应用三提取方法及条件四提取流程五常见问题解答
目录
一质粒基础知识二质粒的构建及应用三提取方法及条件四提取流程五常见问题解答
1.质粒的定义 2.质粒的分类
1.1 质粒的定义
➢ 质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
3.2 耗材
➢ 各种规格枪头、移液枪 ➢ PCR管 ➢ 1.5mLEP管 ➢ PCR板 ➢ 双面板
3.3 仪器
超净工作台
离心机
3.3 仪器
高压灭菌锅
电热恒温鼓风干燥箱
3.3 仪器
水平电泳仪
摇床
3.3 仪器
凝胶成像系统
微波炉
目录
一质粒基础知识二质粒的构建及应用三提取方法及条件四提取流程五常见问题解答
质粒的特征
① 质粒具有自我复制的能力。 ② 质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。 ③ 质粒可自行丢失与消除。 ④ 质粒的转移性。 ⑤ 质粒可分为相容性与不相容性两种。
2.1 载体的特点

质粒DNA的提取31页PPT

质粒DNA的提取
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯

质粒DNA的提取和纯化 PPT

电泳鉴定
• 其中超螺旋结构泳动最快； • 其次为线性结构； • 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两
个质粒连在一起）；
感谢您的聆听！
eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴 2分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中
5-10分钟，4℃下12000g离心10分钟。
6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的
饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4℃下12000g离心10分钟。
溶液III——中和溶液，复性质粒DNA；
酚/氯仿（1:1）
分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。
酚——变性蛋白质；氯仿——萃取溶液中的酚；
乙醇
无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒 DNA；
70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；
琼脂糖凝胶
• 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。
溶液I
• 50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（ pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌 15分钟，储存于4℃冰箱
溶液I：重悬细菌；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀； Tris－HCl：缓冲体系； EDTA：螯合金属离子；
• 凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。
电泳
6×loading buffer 2l
样品
10l

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，
使DNA复性。但是质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形
成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋
白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
溶液I：低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
溶液II：SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。
精心整理
18
5. 氨苄青霉素（Amp）
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6. RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
6
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.
精心整理
7
pET-32 cloning/expression region
17
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L）；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸； 28.5ml H2O
精心整理
8
Gene fragment (SmPR10)
Vector (pET-32a)
精心整理
pET-32a-SmPR10
9
质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液p1Hk恢b到复2至00中kb性时, 在高盐浓>度4的00情0k况b 下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA 及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
实验一质粒DNA的提取
精心整理
1
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
精心整理
2
实验目的
了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法；掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
精心整理
3
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。
精心整理
20
6. 15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 l ）。
7. 加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻）， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。
1. LB液体培养基（1L）胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml，搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调
节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L）
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
精心整理
3. 加入100 l SolutionI，涡旋使细胞充分悬浮。 4. 加入200 l SolutionII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混匀
（注意动作轻），冰上放置5min。 5. 加入150 l SolutionIII，立即上下颠倒离心管5-10次，使之混
匀（注意动作轻），冰上放置5min。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
精心整理
4
结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
精心整理
5
精心整理
精心整理
21
9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃ 离心，15,000rpm，10min。
7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇，75%乙醇。
精心整理
19
实验步骤
质粒的提取
1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入1-2ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。
2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，弃上清液。
精心整理
10
实验仪器恒温摇床
2. 超净工作台
3. 高压灭菌锅
4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
精心整理
11
精心整理
12
精心整理
13
精心整理
14
精心整理
15
（二）材料
大肠杆菌E. coli DH 5α含重组质粒 pET-32a-SmPR10
精心整理
16
（三）试剂