实验一 低拷贝质粒的大量提取

分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。

2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。

3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。

4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。

另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。

5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。

对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。

6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。

7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。

9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。

10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。

PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。

2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。

另外，不要使⽤过多菌体。

经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。

质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。

质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。

当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。

要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。

碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。

溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。

溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，无菌水28.5 mL，4℃保存，使用时置于冰浴中。

下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。

质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。

质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。

当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。

要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。

碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。

溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。

溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。

下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。

实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。

5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。

冰上放置15min。

7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。

9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。

质粒DNA的提取实验报告质粒DNA的提取⼀、实验⽅法碱裂解法抽提质粒DNA⼆、实验原理基于质粒DNA与染⾊体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离⼼收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离⼼管中。

2. 加⼊100µl溶液1，振荡⾄彻底悬浮。

3. 加⼊200µl溶液2，⽴即轻柔颠倒离⼼管6次，使菌体充分裂解，随后将离⼼管冰上放置3分钟4. 加⼊150µl溶液3，⽴即温和颠倒离⼼管数次，冰上放置3分钟，10，000g离⼼10min。

5. 将步骤4的上清转移⾄新的离⼼管（尽量去除杂质），加⼊等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离⼼5min。

6. 将步骤5的上清转移⾄新的离⼼管，加⼊2倍体积的⽆⽔⼄醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离⼼10分钟,弃⼄醇，保留沉淀，加⼊1ml 70％的⼄醇洗涤沉淀，10，000g离⼼5分钟8. 倒掉⼄醇溶液，⽤吸⽔纸吸净管壁上的⽔珠，室温蒸发痕量⼄醇9. 加⼊适量含RNase的TE或灭菌双蒸⽔溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加⼊荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋⽩质和脂类等物质，因此⽤碱裂解法除去杂质1、防⽌DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防⽌DNA受机械剪切作⽤降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染⾊体DNA变性2）离⼦型表⾯活性剂SDS可溶解膜蛋⽩3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染⾊体DNA形成缠连的不溶性⽹状结构，和不稳定的⼤分⼦RNA以及变性的蛋⽩质和细菌碎⽚等⼀起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染⾊染料分⼦可嵌⼊双链DNA分⼦配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分⼦筛的作⽤，因所带电荷、分⼦量⼤⼩和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分⼦数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中⼀条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：/thread-29246-1-1.html涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。

蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。

建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。

同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。

解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。

3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。

只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。

而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。

2、肉眼观察活化菌株。

对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。

】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

2、初步了解DNA纯化的原理。

二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。

3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2 200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3 150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min 下离心10min11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥13、加入1*TE 40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

质粒dna的提取实验报告质粒DNA的提取实验报告。

实验目的，通过实验，掌握质粒DNA的提取方法，了解质粒DNA的结构和特点。

实验原理，质粒DNA是细菌细胞内的一种环状双链DNA，具有自主复制的能力。

提取质粒DNA的方法一般包括细胞破裂、蛋白质和RNA的去除、质粒DNA的纯化等步骤。

实验材料，细菌培养物、质粒DNA提取试剂盒、离心管、离心机、PCR仪等。

实验步骤：1. 取细菌培养物1ml，进行细菌离心，将菌体沉淀。

2. 加入细菌破裂液，使菌体破裂释放质粒DNA。

3. 加入蛋白酶和RNase，去除蛋白质和RNA。

4. 用离心机离心，将沉淀物中的DNA纯化。

5. 用PCR仪进行PCR扩增，验证提取的质粒DNA。

实验结果：经过实验，成功提取到了质粒DNA。

通过PCR扩增，验证了提取的质粒DNA 的完整性和纯度。

实验结论：通过本次实验，我们成功掌握了质粒DNA的提取方法，了解了质粒DNA的结构和特点。

质粒DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，掌握了这一技术，将为我们今后的科研工作提供有力支持。

实验注意事项：1. 在实验过程中要注意细菌培养物的处理和离心操作的安全性。

2. 实验中使用的试剂盒要按照说明书操作，注意避光和保存条件。

3. 实验过程中要注意保持实验环境的清洁和整洁，避免外源DNA的污染。

4. 实验结束后要及时清理实验台和设备，保持实验室的整洁。

通过本次实验，我们不仅掌握了质粒DNA的提取方法，还培养了实验操作的技能和实验室的安全意识。

这对我们今后的科研工作具有重要的指导意义。

扬州大学本科生毕业论文论文题目：质粒大量提取及纯化学生姓名：张晨所在学院：动物科学学院专业班级：动科06 指导老师：宋成义教授完成日期：2010年6月质粒大量提取及纯化动物科学张晨指导老师宋成义摘要：为了探讨氯霉素对重组质粒DNA提取产量的影响，本试验在含重组质粒pT2/HB-CMV-EGFP的大肠杆菌DH5α培养到对数生长期时添加氯霉素继续培养12小时，收集细菌用碱裂解法粗提质粒DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。

结果表明，氯霉素可有效的促进松弛型重组质粒DNA拷贝数的增加，从而达到提高质粒DNA产量的目的。

为了优化质粒DNA纯化过程中溶液A的用量，本试验将同一份粗提质粒DNA平分成三组，分别加入不同量的溶液A。

纯化后测定各组DNA浓度和纯度，结果表明，溶液A用量（ml）:质粒DNA量(mg)为1:2时，纯化效果最好。

关键词：质粒提取；氯霉素；纯化Extraction and purification of Large-scale plasmid DNAZHANG ChenAbstract:To study the effect of chloramphenicol on plasmid DNA preparation, in this experiment the chloramphenicol was added to the recombinant E. coli culture at the logarithmic growth phase，and then the plasmid DNA was extracted by using the traditional alkaline method. Concentration and purity of the plasmid DNA was detected and the results showed that chloramphenicol could effectively increase the copy number of relaxed plasmid and increase the output of the plasmid DNA. In order to optimize the amount of solution A which was used to purify plasmid DNA, different amount of solution A was added to the coarse extraction of plasmid. Then the concentration and purity of the puritied plasmid DNA was determined.The results showed that the purification effect was the best when the proportion of solution A(ml) andcoarse plasmid DNA(mg) was by 1-2.Key Words:extract of plasmid DNA;chloramphenicol;purification;质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子,其分子量一般在0.2～10kD范围内[1]。

质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。

质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。

当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。

要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。

碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。

溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。

溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。

下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。

E．coli质粒的大量抽提及纯化方法1、前一天晚上将要抽提的菌种接种一单菌落到盛有100mL液体培养基的500mL 三角瓶中，于37℃，250rpm摇床培养过夜。

2、将此培养液转移至2个50mL离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、向2个离心管中各加5mLSolⅠ，剧烈振荡使菌体尽可能均匀重悬。

4、向2个离心管中各加10mLSolⅡ，轻轻颠倒离心管，使液体尽可能混合均匀。

5、向2个离心管中各加7.5mLSolⅢ，轻轻颠倒离心管，使内容物沉淀，并于冰上放置30分钟以上。

6、以5000rpm离心15分钟，然后用擦镜纸过滤至干净的50mL离心管中。

7、向2个离心管中各加入12mL的异丙醇，颠倒离心管使混匀，并于冰上放置30分钟以上。

8、以6000rpm离心15分钟，弃上清液，每个50mL离心管中的沉淀用2mLTE （pH8.0）溶解并转移到1个5mL离心管中。

9、向2个5mL离心管中各加入2mL5mol/LLiCl溶液，振荡使混匀，于冰上放置片刻，8000rpm离心15分钟。

10、每个5mL离心管中的上清液转移到2个干净的5mL离心管中，向各管中加入等体积的异丙醇，于冰上放置片刻，以8000rpm离心15分钟，弃上清液。

11、用50μL50μg/mL的Rnase TE（pH8.0）溶液溶解每管中的沉淀，合并各管中的液体，转移到一干净的1.5mL的离心管，并于37℃水浴30分钟以上。

（此步之后可将质粒存放于－70℃冰箱，第二天接着纯化）。

12、向各管质粒溶液中加入450μL的13﹪PEG80001.6mol/LNaCl溶液，于冰上放置片刻，12000rpm离心10分钟，弃上清液。

13、每管中加入400μL的TE（pH8.0）液溶解沉淀，然后加入1mL酚氯仿，剧烈振荡均匀，于冰上静置片刻，以12000rpm离心10分钟。

（若界面蛋白沉淀较多，可再用酚氯仿抽提一次）14、小心吸取上清液至干净的1.5mL离心管，敞开管口，55℃水浴30分钟左右使有机溶剂挥发。

质粒大抽（手提）步骤资料来自网络，适当改进试剂配制：Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。

1M NaOH (400ml )：分子量：40，秤取16g NaOH，溶于400ml 双蒸水中。

2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml 双蒸水中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。

10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。

Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml 双蒸水，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。

Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml 双蒸水，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。

(注：不需要定容，严格按步骤操作)Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml 双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。

质粒大抽步骤质粒大抽（手提）步骤资料来自网络，适当改进试剂配制：Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MOPS 10.46g，加入600ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QF （1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。

1M NaOH (400ml )：分子量：40，秤取16g NaOH，溶于400ml 双蒸水中。

2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml 双蒸水中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。

10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。

Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml 双蒸水，用HCl调节pH 值为8.0，定容至1000ml。

Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml 双蒸水，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。

(注：不需要定容，严格按步骤操作)Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml 双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。

质粒提取实验：碱裂解法提取方案质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子，其分子量一般在0.2-10KD范围内。

由于质粒分子小，便于分离和提取，可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。

质粒提取方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

质粒提取是分子生物学实验的基础技能和基本要求，基因克隆实验中常将经改造后的质粒作为运送基因的载体，质粒提取质量的好坏直接影响到酶切、连接、转化等后续实验，因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义。

提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。

实验室中常用碱裂解法提取质粒，该法操作简便，但若明确其中主要试剂的作用，所提取的质粒DNA的纯度及质量会更高。

下面简单介绍一下碱裂法提取质粒。

原理细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。

只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。

当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

主要试剂的作用原理氢氧化钠的作用：在碱裂解法中，氢氧化钠的作用原理是使细胞膜由脂双层结构向囊泡化转变，从而使细胞裂解，氢氧化钠的作用既能裂解细胞让细胞内含物释放出来，又是质粒DNA和染色体DNA得以分离的关键。

质粒提取常见问题解析质粒提取常见问题解析质粒, 解析本帖引用网址：涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。

蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。

建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。

同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常？参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。

解决办法：1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。

3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。

只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。

而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。

2、肉眼观察活化菌株。

对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。

】未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。