当前位置：文档之家 › 实验3 质粒的提取和鉴定090226

实验3 质粒的提取和鉴定090226

  • 格式：ppt
  • 大小：325.50 KB
  • 文档页数：32

下载文档原格式

  / 32

合集下载

提取质粒实验报告

提取质粒实验报告

提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。

本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。

实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。

- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。

- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。

- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。

- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。

- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。

- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。

- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。

- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。

- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。

- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。

- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。

- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。

- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。

- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。

- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。

实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。

通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。

此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。

通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒dna的提取与鉴定实验报告质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言：DNA是生物体内重要的遗传物质，其中质粒DNA作为细菌细胞外的环状DNA 分子，在基因工程、遗传学和生物技术研究中具有重要的应用价值。

本实验旨在通过提取和鉴定质粒DNA，探究其结构和功能。

材料与方法：1. 细菌培养液：含有质粒DNA的细菌培养物。

2. 离心管：用于离心细菌培养物。

3. 离心机：用于离心细菌培养物。

4. 细胞裂解液：用于破坏细菌细胞壁，释放质粒DNA。

5. 蛋白酶K：用于降解蛋白质，去除细胞核酸。

6. 高盐溶液：用于沉淀质粒DNA。

7. 乙酸：用于沉淀DNA。

8. 冷乙醇：用于沉淀DNA。

9. 紫外分光光度计：用于测定DNA的浓度和纯度。

10. 凝胶电泳仪：用于鉴定提取的质粒DNA。

实验步骤：1. 取适量细菌培养液，离心细菌培养物，收集菌体沉淀。

2. 加入适量细胞裂解液，充分混匀，使细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA。

3. 加入适量蛋白酶K，降解蛋白质，去除细胞核酸。

4. 加入高盐溶液，使质粒DNA沉淀。

5. 离心沉淀，收集质粒DNA。

6. 加入适量乙酸和冷乙醇，沉淀DNA。

7. 离心沉淀，收集DNA。

8. 使用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度。

9. 使用凝胶电泳仪鉴定提取的质粒DNA。

结果与讨论：通过实验，我们成功提取了质粒DNA，并进行了鉴定。

首先，通过紫外分光光度计测定，我们得到了DNA的浓度和纯度。

浓度的高低反映了提取的DNA量，纯度则表示DNA中杂质的含量。

高浓度和高纯度的DNA适合用于后续实验。

其次，通过凝胶电泳仪鉴定，我们观察到了DNA的迁移带，根据迁移带的大小和形状，可以判断DNA的大小和完整性。

此外，我们还可以通过与已知大小的DNA标准品对比，确定提取的质粒DNA的大小。

质粒DNA的提取与鉴定是基因工程和生物技术研究中的重要步骤。

通过提取质粒DNA，我们可以获取特定基因的DNA序列，用于进一步的分析和研究。

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。

质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。

提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。

本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。

实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。

2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。

步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。

2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。

步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。

不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。

2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。

3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。

不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。

4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。

步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。

2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。

步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。

2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。

质粒提取实验报告

质粒提取实验报告

质粒提取实验报告质粒提取实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，它的目的是从细菌中提取质粒DNA。

质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌细胞质中，具有自主复制的能力。

质粒提取实验对于研究基因功能、基因工程以及遗传学等领域具有重要意义。

实验材料与方法：本次实验所用材料包括细菌培养物、质粒DNA提取试剂盒、离心管、离心机等。

实验步骤如下：1. 选择合适的细菌培养物，如大肠杆菌。

2. 将细菌培养物转移到含有适当抗生素的琼脂平板上，孵育过夜。

3. 从琼脂平板上挑取单个菌落，接种到含有适当抗生素的培养基中，培养过夜。

4. 将过夜培养的细菌转移到含有适当抗生素的液体培养基中，继续培养。

5. 收集培养物，离心沉淀细菌细胞。

6. 使用质粒DNA提取试剂盒进行质粒提取。

实验结果与讨论：经过以上步骤，我们成功地从细菌中提取到质粒DNA。

提取的质粒DNA经过琼脂糖凝胶电泳分析，显示出明亮的DNA条带。

这些条带的大小与我们预期的质粒大小相符，证明提取的质粒DNA质量良好。

质粒提取实验的成功与否受到多个因素的影响。

首先，选择合适的细菌培养物非常重要。

常用的大肠杆菌是质粒提取实验的理想选择，因为大肠杆菌具有较高的质粒含量。

其次，培养条件的控制也是关键。

适当的培养时间和培养温度可以提高质粒的复制效率。

此外，质粒提取试剂盒的选择和使用方法也会对实验结果产生影响。

正确操作试剂盒中的各个步骤，如细胞破裂、DNA纯化和洗涤等，是保证实验成功的关键。

质粒提取实验在科学研究和应用中有着广泛的应用。

首先，通过质粒提取实验可以获得大量的质粒DNA，为基因克隆、基因测序等实验提供了材料基础。

其次，质粒提取实验也是进行基因工程技术的前提。

通过将目标基因插入质粒中，可以实现基因的定向表达和转基因等操作。

此外，质粒提取实验还可以用于研究细菌的耐药性、毒力因子等重要基因的分析。

然而，质粒提取实验也存在一些局限性。

首先，质粒提取实验只能提取到细菌中的质粒DNA，无法获取真核生物的质粒。

质粒的提取与鉴定实验报告

质粒的提取与鉴定实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。

同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。

关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。

实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。

三、 质粒DNA的提取和电泳鉴定

三、 质粒DNA的提取和电泳鉴定
为反向重复序列 ）特征。
2. 质粒的酶切鉴定：
质粒DNA酶切反应体系 ▪ 10酶切buffer 1 l
▪ 质粒DNA
▪ EcoR1（10u/l）
5 l
1 l
▪ BamH1（ 10u/l ） 1 l
▪ ddH2O加至
10 l
▪ 37℃水浴保温1h；72 ℃水浴15min终止反应。
3.电泳检测目的基因片段
10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻
柔，同时控制好时间！
6. 加入 150μl 预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴 5min。一定要
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ充分混匀！
实验步骤
7.
8. 9.
4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP 管中。
加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清 液。 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
而染色体 DNA 、大分子 RNA 以及蛋白质 -SDS 复合 物等形成沉淀，可通过离心去除。
实验步骤
1. 在含相应抗生素（ Amp ）的 LB 中接入一单菌落（白色），于 37℃ 剧 烈振摇下培养过夜。 2. 取1.5ml对数生长期的菌体于 Eppendorf 管中，8000rpm 离心1min， 收集菌体。 3. 4. 5. 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加 入 200μl 新 鲜 配 制 的 NaOH-SDS （ 100μl 2mol/L NaOH+100μl

《分子生物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告

《分子生物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告

《分⼦⽣物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告质粒DNA的提取与鉴定实验⽇期2020年5⽉14⽇室温25°C 成绩⼀、实验报告摘要【实验题⽬】质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定【实验⽬的】1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作⽤。

2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。

⼆、实验原理1、质粒：质粒是独⽴存在于染⾊体外，能⾃主复制并能稳定遗传的⼀种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及⼀些动植物细胞中。

细菌质粒是应⽤最多的质粒类群，在细菌细胞内利⽤宿主细胞的复制机构复制质粒⾃⾝的DNA2、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA⽚段的标准⽅法之⼀，该技术操作简便，快速。

⽤各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp⾄近50kb的DNA。

此外，直接⽤低浓度的核酸染料进⾏染⾊，可确定DNA在凝胶中的位置。

琼脂糖凝胶通常采⽤⽔平装置在强度和⽅向恒定的电场下电泳。

三、操作要点：（1）质粒DNA的提取1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加⼊2mL的塑料离⼼管(⼦弹头)内，每次以12000r/min离⼼1min(注意平衡)弃去上清液。

2、加⼊100uL⽤冰预冷的溶液I，⽤移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。

(溶液I放置冰中)3、加⼊200uL溶液II，盖紧盖⼝，翻转离⼼管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离⼼管置于冰上。

4、加⼊150uL⽤冰预冷的溶液III，盖紧盖⼝，翻转离⼼管，温和摇匀直⾄粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。

(溶液放置冰中)5、⽤微量离⼼机12000r/min离⼼5分钟。

取上清液移到另⼀离⼼管。

6、加⼊等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离⼼7分钟，将上清液收集到新的离⼼管中。

7、加⼊2倍体积100%⼄醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离⼼5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上⼲燥，漓尽液体。

8、⽤1m170%⼄醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空⽓⼲燥10min。

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。

2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。

常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。

本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。

步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。

2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。

3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。

4. 加入溶解剂，使细胞溶解。

5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。

6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。

7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。

3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。

2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。

3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。

3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。

2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。

3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。

3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。

2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。

3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。

2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。

3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。

2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。

3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。

3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。

2.将上清液倒出，保留下沉淀。

3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。

2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。

4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。

实验--质粒DNA的提取与检测

实验--质粒DNA的提取与检测

实验--质粒DNA的提取与检测实验质粒DNA的提取与检测⼀、实验⽬的1、学习质粒DNA 的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理；2、掌握质粒DNA 的提取⽅法；3、掌握电泳检测DNA的⽅法。

⼆、实验原理质粒(Plasmid)是⼀种染⾊体外的稳定遗传因⼦,⼤⼩从1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分⼦,以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有⾃主复制和转录能⼒,能在⼦代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。

在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产⽣其它形式的质粒DNA。

如果质粒DNA 两条链中有⼀条链发⽣⼀处或多处断裂,分⼦就能旋转⽽消除链的张⼒,形成松驰型的环状分⼦,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同⼀处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。

当提取的质粒DNA 电泳时,同⼀质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要⽐开环和线状分⼦的泳动速度快。

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA ⽚段的标准⽅法。

琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为⼀种固体⽀持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。

在电场中,在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: DNA 的分⼦⼤⼩，琼脂糖浓度，DNA 分⼦的构象，电源电压，嵌⼊染料的存在及离⼦强度等。

该技术操作简便快速，可以分辨⽤其它⽅法（如密度梯度离⼼法）所⽆法分离的DNA ⽚段。

当⽤低浓度的荧光嵌⼊染料溴化⼄啶(Ethidium bromide, EB）染⾊,在紫外光下⾄少可以检出1-10ng 的DNA条带，从⽽可以确定DNA⽚段在凝胶中的位置。

三、材料、设备及试剂1.材料：含pET32a的E. coli DH5α菌株，1.5ml 塑料离⼼管(⼜称eppendorf 管),离⼼管架。

质粒DNA的提取和鉴定

质粒DNA的提取和鉴定

五、注意事项——材料准备
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增 加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加 大菌体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
➢ 菌体量适当。
➢ 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
策
使用浓度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
六、质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
三、实验仪器、材料与试剂
▪ 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机 相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： ▪ 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM EDTA
作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 ▪ 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 ▪ 溶液III 5M KAC
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒dna的提取与鉴定实验报告

质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。

二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。

提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。

鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。

三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。

四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。

五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。

根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。

六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。

同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。

通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。

质粒DNA的提取和鉴定

质粒DNA的提取和鉴定

该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，

质粒的提取及鉴定

质粒的提取及鉴定

接
宿主细胞
＋
重组体
转
已转化的宿主细胞
繁殖
筛
阳性克隆株
表达
2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
33
实验七
质粒DNA质粒DNA的 浓度测定与双酶切鉴定
4.紫外线照射不要太久。尤其避免直接照射皮肤。
质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整 合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
28
基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
＋
目的基因
实现基因克隆所 采用的方法及相 关的工作统称为 重组DNA技术， 又称基因工程。
39
限制性核酸内切酶命名 Hin dⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
限制性核酸内切酶的切割方式
实验步骤
RNA酶消化除去RNA，并用除去残留的蛋白质
试剂盒主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对

实验3质粒的提取和鉴定090226ppt课件

实验3质粒的提取和鉴定090226ppt课件
3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切 酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内 切酶的活力；
4. 操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防 止操作中对内切酶的污染。
5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备 一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、 乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均 在不同程度影响限制性内切酶的活性。
鲜配制）
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM
EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
• 9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。
• 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放 置5min。室温放置15min干燥。
• 11．50μL TE缓冲液（含无DNase的RNase 20 µg/ml） ，使DNA完全溶解（-20℃保存）
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含
Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，
37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，
质粒DNA的提取方法
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析 法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理

质粒的提取纯化实验报告

质粒的提取纯化实验报告

质粒的提取纯化实验报告
提取纯化是从原始样品中提取和纯化指定的物质的一种实验报告。

本篇报告用来描述提取纯化质粒的实验过程，以及实验结果。

实验过程：首先，我们准备了足够的原料，准备质粒提取纯化实验。

然后，将原料均匀地放到实验中，重复混合，以保证原料的均匀性。

接下来，将混合物加入热水，加热混合物，以使提取物溶于水中。

加热时间一般为20分钟。

之后，用冷却器冷却混合物，使其中的物质凝固，并以滤纸过滤，以收集混合物中的质粒。

最后，将滤纸上的质粒收集，然后放入蒸馏瓶，用蒸馏仪蒸馏，以去除杂质，完成质粒提取纯化实验。

实验结果：实验中提取出来的质粒数量较多，质量较高。

通过蒸馏仪蒸馏，以去除混合物中的杂质，从而获得了纯的质粒样品。

在质量分析中，实验中提取出的质粒的纯度较高，平均纯度为
98.7%，质量较好。

综上所述，本次实验完成了质粒提取纯化实验，实验结果表明，提取出的质粒数量较多，质量较高，纯度较高，且质量较好。

实验按照预期正常进行，达到了预期效果。

质粒DNA的提取鉴定

质粒DNA的提取鉴定

实验三质粒DNA的提取鉴定一、原理质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位.基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞.广义的质粒还包括霉菌、蓝藻和酵母质粒以及动植物细胞中的线粒体和质体等。

细菌质粒是环状双链DNA分子，其他少数质粒是线性DNA分子，而酵母的杀伤质粒则是RNA。

环状质粒的DNA分子具有超螺旋性质,长度可以从1kb到200kb左右不等。

质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列,通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。

按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体(如pMD18—T)和表达载体(如pET—X、pBI121等）。

克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子，因而不能转录,主要用于目的片段的大量制备。

表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体（如大肠杆菌)和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控,可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。

根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同,可分为两类:一类是“松驰型”质粒，如pMB1/colE1复制子,其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控,不需要任何质粒编码的蛋白质，完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下,其复制仍不停止，即所谓的“松驰"方式复制，其在宿主细胞中拷贝数较多，一般如常用的pUC系列可达500～700个；二是“严紧型”质粒，如pSC101，其复制伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白质合成受阻,其拷贝数就不能增加,即在宿主的“严紧”控制下复制，其在宿主细胞中拷贝数通常仅有1～5个。

在分子生物学研究中,为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA,通常使用的是“松驰型”质粒;但在某些特殊原因(如表达产物对细胞有毒性）下要求用严紧型质粒。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因 此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构， 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒 连在一起），而不是开环结构 开环结构（用EcoRI来线性化 开环结构 质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样）
4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下
， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1µg底物 DNA的酶量为1单位(1U)。
三 质粒提取实验材料与试剂
（一）实验材料：
过夜培养大肠杆菌DH-5a （二）实验试剂： LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、 1mM EDTA、 Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鲜配 制）
5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备 ： 一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、 乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均 在不同程度影响限制性内切酶的活性。
反应缓冲液：
1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+ 组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之 间； B. NaCl浓度：
碱变性法小量提取质粒 DNA的限制性酶切
厦门大学医学院 分子生物学实验教学组
目的
• 掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常 用的提取基因工程中运载基因的载体 • 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基 因和实验目的选择合适载体与限制性内切 酶，设计构建体外重组分子
• 质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复 制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和 细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。
• 9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。 • 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放 置5min。室温放置15min干燥。 • 11．50μL TE缓冲液（含无DNase的RNase 20 µg/ml） ，使DNA完全溶解（-20℃保存） • 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
原理示意图
• 限制性核酸内切酶: 限制性核酸内切酶:
一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解 酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端 为-OH。
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中 （含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中， 37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离 心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃， 离心30sec，弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入 10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰 上放置1分钟。 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
Hale Waihona Puke 七．思考题1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质 粒时要注意什么事项？ 2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在实验 中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其 成因是什么？ 3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象？为什么？ 4.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？
凝胶成像结果
1.2% Agarose Gel
1 2 3 4
1.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder
六．注意事项
为提高质粒产量，要注意下面步骤： • 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬 浮； • 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白 质和核酸变性； • 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质 粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开， 否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 • 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几 次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才 可以放到冰箱中去沉淀DNA。
• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于 纯化的技术和实验要求
碱裂解法
基本原理： 1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质 粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离 心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复 性而呈絮状，离心时可沉淀下来
限制性核酸内切酶分类
• 识别切割特性 • 催化条件 • 是否具有修饰酶活性
• 至2005年1月，共发现限制酶3681种
–Ⅰ 型59种 –Ⅱ 型3612种 –Ⅲ 型10种
• 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制 酶中共有 221 种特异性。
Ⅱ型限制与修饰系统
• 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们 能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的DNA片段； • Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅 助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复 顺序； • Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5’ 端突出，3’端突出和平末端。
5. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？
6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量？
7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个 反应体系的10%？
注意
• EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应 带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该 染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的 器皿或物品，必须进行清洗或弃去
双酶切实验材料
• 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ • DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 • 10×buffer H （37℃, PH7.5）
90mM Tris•Cl 50mM NaCl 10M MgCl2
• 10×buffer M（37℃, PH7.5）
6mM Tris•Cl 100mM NaCl 6M MgCl2
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA， 2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
• 1mM DTT • 10×BSA： 1mg/ml • 无菌水
方法和步骤
反应体系配制： 1. 反应体系配制：
质粒pCDNA3－p38 10×buffer M 10×BSA EcoRⅠ XbaⅠ H2O 总体积 10 µl（1µg） 2 µl 2 µl 1 µl 1 µl 4 µl 20 µl
—————————————————
2. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离 心收集液体。 3. Eppendorf管于37℃水浴中反应2~3小时。 4. 反应结束后70℃灭活15min或者加入EDTA至终浓 度10mM终止反应。 5. 取20µl反应液加入6×loading buffer混匀于1.2 ％琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min 加入5µl 未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要 的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射 DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线 伤害。
低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl)
2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃
，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也 有如BclⅠ需在50℃下进行反应。
3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比
来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分 酶解。
五 实验结果
• 双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释 倍数×50/1000。