腺病毒介导
- 格式:pdf
- 大小:409.79 KB
- 文档页数:6
什么是腺病毒载体?腺病毒(adenovirus )腺病毒颗粒没有包膜的直径为70~90nm 的颗粒,由252个壳粒呈二十面体排列构成。
每个壳粒的直径为7~9nm。
衣壳里是线状双链DNA分子,约含35 000 bp,两端各有长约100 bp的反向重复序列。
腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳,病毒的基因组被包装进去,形成有感染能力的病毒颗粒,并终裂解宿主细胞被释放出去,完成腺病毒的生活周期。
特点:1.腺病毒具有宿主范围非常广,能感染增殖和非增殖各种细胞,如肝细胞、血管内皮细胞等2.腺病毒基因组较大(36kb)绝大多数基因组均能被外源基因取代,故插入大片段外源基因的潜力大。
3.不整合到染色体中,目的基因在宿主细胞基因组外游历状态下表达,无插入致突变性,对人致病性低;4.是瞬时转染,表达快速,容易将外源基因直接转移到靶细胞中,有效表达成活性蛋白。
5.能自行复制,有效进行增殖,产生滴度高;6.与人类基因同源;7.能在同一细胞株或组织中设计表达多个基因。
简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中,或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
综上腺病毒载体的特点,产生了其应用和意义:1.应用于体内接种疫苗。
用携带**调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应肿瘤细胞以诱导抗肿瘤**反应,可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。
2.应用于信号转导,基因转位,Co-IP,动物实验,干细胞研究等科研实验。
3.可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
4.产生滴度高,非常适于基因**。
例如:Rosenfeld等用构建的含肌糖原磷酸化酶cDNA的重组腺病毒感染肝细胞,糖原磷酸化酶活性增加46倍,提示可以对糖原蓄积**进行基因**。
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体,比如AdMax的Kit C、Kit D等,其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体,比如Kit A、Kit B等,外源片断要求小于5 kb。
注意,外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体?腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分,不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验,完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性?提高腺病毒的活性,关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程,如果扩增的病毒滴度高,那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR(未翻译区)的额外的碱基会影响蛋白表达吗?UTR尽可能短一些,特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段(6-9bp)的碱基序列可以增强目的基因的表达,比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞?参照文献报道是很简单的办法,也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞(包括分裂和非分裂细胞),比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞,比如乳腺癌、白血病细胞等,感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验(in vitro)中应注意哪些问题?1)由于细胞表面受体的差异,腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2)在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒,因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
腺病毒常见问题与解答1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?有要求。
对E1和E3双缺失的腺病毒载体,比如AdMax的Kit C、Kit D等,其总包装的外源片断要求小于8 kb。
而对于只有E1缺失或E3缺失的载体,比如Kit A、Kit B等,外源片断要求小于5 kb。
注意,外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。
2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体?腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分,不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。
根据经验,完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性?提高腺病毒的活性,关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。
纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程,如果扩增的病毒滴度高,那么纯化后就会更高的。
4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR(未翻译区)的额外的碱基会影响蛋白表达吗?UTR尽可能短一些,特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。
在起始密码子ATG 前面可以加一小段(6-9bp)的碱基序列可以增强目的基因的表达,比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。
5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞?参照文献报道是很简单的办法,也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。
Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞(包括分裂和非分裂细胞),比如肝、肌肉、神经组织等。
但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞,比如乳腺癌、白血病细胞等,感染效率较低。
6、腺病毒载体在体外实验(in vitro)中应注意哪些问题?1)由于细胞表面受体的差异,腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。
可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。
2)在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。
避免在消化细胞后立刻感染病毒,因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒(Adenovirus)是一类非常常见的病毒,它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域,腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造,可以将外源基因有效地传递到目标细胞中,并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤:2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型,其中最常用的是腺病毒2(Ad2)和腺病毒5(Ad5)。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成,包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法,可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中,需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞:一种是质粒携带者,将质粒转染进细胞内;另一种是包装细胞,它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中,使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法,如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后,通过转染和转座等过程,腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终,腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒,从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍:•基因治疗:腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病,如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中,可以恢复或增强正常基因的功能,从而治疗相关疾病。
•疫苗开发:腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答!1.目前,对于基因治疗的载体选择,很难有一个统一的结论,文章也很多,我将在如下给出。
本人认为,无论选择哪种载体,关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法,因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因,并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用,目前较为公认的就是病毒载体转染效率高,但副作用大;质粒载体毒性小,但转染效率比较低。
同时,对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体,pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等:这些载体如果用于细胞水平的检测,也许会更加的方便、直观,但是,如果用于体内的基因治疗,那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司()的pCDNA载体系列,会更好一些。
同时,为了获得更加高效的表达,一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体,以增加外源基因的分泌表达。
/vcore/Plasmids/pUMVC6a.htm/vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样,治疗的方法越多,就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样,很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见,还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22,请赐教:用什么方法可以达到最佳效果,脂质体、电转还是重组病毒?如果用脂质体,哪家的最好?H22细胞为悬浮细胞,用病毒(逆转录病毒和腺病毒)最为理想,一是转染效率高,二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%,且影响因素多,而腺病毒感染效率高,几乎可达100%,但只能短期表达(7-10天),随着细胞传代,外源基因会逐渐丢失。
当然,H22也可用脂质体进行转染,筛选应在96孔板上进行,由于培养液少、细胞相对静止,两周后可见细胞克隆生长,在倒置显微镜下用吸管吸取克隆,进行扩大培养。
腺病毒简介1 简介 ⼈体腺病毒已知有52种,分别命名为adl~ad52,研究得最详细是ad2。
腺病毒基因组转录产⽣mRNA,已知的转录单位⾄少有5个:EⅠ区位于病毒基因组左侧,可再分成EⅠA和EⅠB,与细胞转化有关;EⅡ区编码DNA结合蛋⽩,参与病毒的复制;EⅢ区编码出现在宿主细胞表⾯的⼀种糖蛋⽩;EⅣ区位于ad2基因组右端,受EⅡ区编码的DNA结合蛋⽩质调控;第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋⽩质Ⅳ。
腺病毒对啮齿类动物有致癌能⼒,或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。
使细胞转化只需要腺病毒基因组的⼀部分,这些基因位于基因组的左端,约占整个基因组的7%~10%。
尽管腺病毒分布很⼴,但对⼈体不出现致癌性。
⼈体细胞是⼀类允许细胞(permissive cell),即这类细胞允许感染⼊侵的病毒在细胞内复制增殖,最后细胞裂解死亡⽽释放出⼤量⼦代病毒。
在体外培养的多种⼈体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒,但在⼈的1号染⾊体上有adl2的整合位点,这意味着⼈体细胞对于腺病毒也可能是⾮允许细胞,即这类细胞在病毒感染后,病毒不能在细胞内复制增殖,但可整合在受感染细胞的基因组内。
这些细胞被病毒转化,表型发⽣改变,且可在体外⽆限期地培养传代。
2 化学组成 腺病毒是⼀种⽆包膜的双链DNA病毒,基因组长约25-45kb,理论上可编码22-40个基因。
⾐壳(capsid)呈规则的20⾯体结构,直径约80-110nm。
⾐壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤⽑(fiber),除此之外还有其他⼀些⼩蛋⽩,如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。
六联体是形成病毒⾐壳20个三⾓形⾯的主要蛋⽩,12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤⽑蛋⽩构成的复合物,12根纤⽑以五联体蛋⽩为基底由⾐壳表⾯伸出,纤⽑顶端形成头节区(knob)。
五联体和纤⽑的头节区可与细胞表⾯的病毒受体结合,在病毒感染细胞过程中起着⾮常重要的作⽤。
硕士研究生学位论文摘要目的:本研究筛选了p53基因状态不同的两种人肺腺癌细胞系,以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将野生型p53基因cDNA分别导入这两种细胞,并在细胞内获得表达后,观察p53基因的放射增敏作用,并探讨其机制,为临床开展基因放射治疗提供实验依据。
方法:本实验分为三部分。
第一部分选取人肺腺癌细胞系A549及GLC一82细胞,通过免疫组化法检测内源性P53蛋白的表达、继而通过PCR—SSCP方法检测细胞中内在p53基因的状态。
第二部分以携带外源性野生型p53基因cDNA及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷型重组体腺病毒为载体,将外源性wtp53分别转入这两种细胞内,通过绿色荧光蛋白及P53免疫组化检测,观察转染效率及外源性基因在细胞内的表达,并选择最佳转染滴度;以含半乳糖苷酶的复制缺陷型腺病毒空载体(hd—LacZ)为对照,绘制细胞生长曲线,观察wtp53对两种细胞系生长的影响。
第三部分以hd—p53转染两种细胞后,分别给予OGy、2Gy、4By不同剂量照射,测定集落形成率,并应用流式细胞仪技术检测外源p53基因对照射后细胞周期及凋亡的影响,应用SPSSIO.0统计软件包对结果进行分析。
结果:hd—p53转染前h549细胞免疫组化染色呈阳性表达,GLC一82细胞呈阴性表达,PCR—SSCP结果提示6LC一82细胞存在p53基因第七外显子突变。
转染后24小时A549细胞免疫组化染色阳性表达增强,GLC一82细胞由阴性表达转为阳性,表明wtp53在细胞内成功的表达。
绿色荧光蛋白检测显示IOOMOI腺病毒载体转染后16小时可达70—80%表达。
转染效率高,以IOOMOI为最佳转染滴度。
细胞生存曲线显示hd—p53对两种细胞系体外生长均有抑制作用,而对GLC一82细胞抑制作用强于h549细胞。
两种细胞转染hd-p53并给予不同剂量照射后的集落形成能力明显下降,随着剂量的增加,下降更为明显:在同一照射剂量下,转染Ad—p53组细胞的集落形成能力最低。
腺病毒介导的nm23-H1对人恶性黑色素瘤A375体外抑制作用的研究李宗河;何学令;刘艳;尹海林【期刊名称】《国外医药(抗生素分册)》【年(卷),期】2011(000)006【摘要】目的观察Ad-GFP-nm23-H1抑制人恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)A375细胞生长和转移的作用,为后期nm23-Hl基因和腺病毒载体用于MM及其它肿瘤的基因治疗提供一定的理论和方法.方法采用MTT法检测Ad-GFP-nm23-H1,对A375细胞增殖力的影响,用细胞基质胶黏附实验黏附力和侵袭能力实验来分别检测Ad-GFP-nm23-H1,对A375细胞粘附力和侵袭能力的影响.结果 Ad-GFP-nm23-Hl可以明显抑制A375细胞的增殖、黏附和侵袭能力,其抑制作用呈剂量一效应关系.结论 Ad-GFP-nm23-Hl,对人恶性黑色素瘤A375细胞的生长和转移具有抑制作用.【总页数】7页(P273-278,286)【作者】李宗河;何学令;刘艳;尹海林【作者单位】四川抗菌素工业研究所,成都610052;四川大学实验动物中心,成都610041;四川大学实验动物中心,成都610041;四川大学实验动物中心,成都610041【正文语种】中文【中图分类】R979.1【相关文献】1.腺病毒介导的反义VEGF165对人皮肤恶性黑色素瘤细胞生长的影响 [J], 崔正军;岑瑛;王立夫2.重组腺病毒载体介导人抑瘤素M基因对胰腺癌细胞体外增殖的抑制作用 [J], 胡朝全;孙诚谊;孙连生;王玉芝3.腺病毒介导的nm23-H1对人结直肠癌裸鼠移植作用的实验研究 [J], 王琦;李华玲;何学令;刘艳;尹海林4.Ad-GFP-nm23-H1裸鼠体内抑制人恶性黑色素瘤A375作用的研究 [J], 李宗河;王琦;尹海林5.腺病毒介导M-CSF、IFN-γ基因分别转染黑色素瘤细胞体外生物学特性的研究[J], 雷虹;曹雪涛;于益芝;周正芳;章卫平;郑玲莉因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
腺病毒载体在基因治疗研究中的应用基因治疗是近年来发展非常迅速的一种新型疗法,其通过改变人体内某些基因的表达或功能,从而达到治疗疾病的目的。
而其中的一种常用方法就是利用腺病毒载体进行基因转导。
下面我们将深入探讨腺病毒载体在基因治疗研究中的应用。
一、腺病毒载体基础介绍首先,我们需要了解什么是腺病毒载体。
腺病毒是一种小型病毒,具有广泛的宿主范围和极高的转导效率,因此成为了基因治疗领域中最常用的载体之一。
腺病毒的基因组为一条线性双链DNA分子,它的大小约为30kb,可以携带大量外来基因负责转导。
同时,腺病毒中的大部分基因已被删减或失活,因此可以在病毒粒子内部容纳更多的外来基因。
二、腺病毒载体的优势相比于其他的基因治疗载体,腺病毒载体具有许多的优势。
首先,腺病毒对人体的免疫应答十分低。
因为腺病毒感染人类的过程通常都是无症状的,在人体内会迅速被淋巴系统清除,因此它不会引起人体免疫反应。
其次,腺病毒的转导效率非常高,因为它具有广泛的靶细胞类型和容易侵入细胞的特性。
最后,腺病毒的基因修饰能力也很高,可以很容易的携带大量的外来基因,在转导过程中基因也不会被分解或改变。
三、腺病毒载体在基因治疗中的应用现如今,腺病毒载体已广泛应用于临床试验和基础研究中。
以传统的疗法为例,在肝脏癌等疾病中常常需要利用手术切除病变组织,但手术切除对机体的侵害很大。
通过利用腺病毒载体送入基因,就可以避免这种创伤,缩短患者的恢复期。
此外,腺病毒载体还可以用于治疗和预防一些遗传疾病,例如囊性纤维化和色素性视网膜炎。
四、腺病毒载体的展望在未来,腺病毒载体极有可能成为基因治疗领域的重要发展方向之一。
随着科技的发展和基因治疗研究的深入,人们可以更加深入的了解腺病毒载体中的机制,并且对其进行更加精确的改造。
同时,人们也需要进行更加深入的实验和测试,以探究腺病毒载体在人体内的表现和转导效率。
这一系列的研究和测试,将为腺病毒载体在基因治疗中的应用提供更好的基础和保障。
汇总了腺病毒的一些常见问题及解答!1.目前,对于基因治疗的载体选择,很难有一个统一的结论,文章也很多,我将在如下给出。
本人认为,无论选择哪种载体,关键在于此载体在局部的表达效率。
无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法,因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因,并且使其具有一定的作用。
而对于载体的副作用,目前较为公认的就是病毒载体转染效率高,但副作用大;质粒载体毒性小,但转染效率比较低。
同时,对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体,pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等:aaaclontechaaa这些载体如果用于细胞水平的检测,也许会更加的方便、直观,但是,如果用于体内的基因治疗,那就不是一个理想的载体了。
而传统的表达载体如INVITROGEN公司(aaainvitrogenaaa)的pCDNA载体系列,会更好一些。
同时,为了获得更加高效的表达,一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体,以增加外源基因的分泌表达。
bbb:///vcore/Plasmids/pUMVC6a.htmbbb:///vcore/Plasmids/pUMVC7.htm正如一个疾病的治疗一样,治疗的方法越多,就证明还没有一个最有效地治疗手段。
基因治疗的载体也是同样,很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。
以上是本人的一点愚见,还请各位同道指正。
2.转染过小鼠肝癌细胞H22,请赐教:用什么方法可以达到最佳效果,脂质体、电转还是重组病毒?如果用脂质体,哪家的最好?H22细胞为悬浮细胞,用病毒(逆转录病毒和腺病毒)最为理想,一是转染效率高,二是不用筛选直接用于实验。
但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%,且影响因素多,而腺病毒感染效率高,几乎可达100%,但只能短期表达(7-10天),随着细胞传代,外源基因会逐渐丢失。
当然,H22也可用脂质体进行转染,筛选应在96孔板上进行,由于培养液少、细胞相对静止,两周后可见细胞克隆生长,在倒置显微镜下用吸管吸取克隆,进行扩大培养。
腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配周玉柏,周玲,吴小兵,曾毅(传染病预防控制国家重点实验室 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所,北京100052)摘要:为研究重组腺病毒载体作为HPV 16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16L 1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。
首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV 16L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod 1HPV 16L1。
将mod 1H PV16L 1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rA d -mod 1HP V16L1。
用免疫印迹法检测病毒感染的293T 细胞中HPV 16L1蛋白的表达。
通过Optipr ep 密度梯度超速离心法纯化HPV 16L1病毒样颗粒(V LPs)。
用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HP V16L 1蛋白自我装配形成的V L Ps 。
结果显示,重组腺病毒载体可介导mod 1H PV16L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L 1蛋白可自我装配形成V LPs 。
关键词:腺病毒;人乳头瘤病毒16型;密码子优化;病毒样颗粒中图分类号:R373 文献标识码:A 文章编号:1000-8721(2006)02-0101-06收稿日期:2005-09-13;修回日期:2005-10-31基金项目:国家高技术/8630计划资助项目(2001AA215221)国家/9730资助项目(2004C9818806)作者简介:周玉柏(1976-),男,湖北武汉人,在读博士研究生,主要从事肿瘤病毒学研究。
通讯作者:周玲,研究员,E -mai l:zhouli ng@doctor 1com 1cn人乳头瘤病毒属乳多空病毒科,是无包膜的闭环双链DNA 病毒,具有上皮细胞嗜性,迄今已分离到超过100种基因型[1,2]。