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石蜡包埋组织的DNA提取近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。
目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。
在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。
通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对开矿学延伸。
通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。
Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。
Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
石蜡块包埋组织怎么用，一文就够了目前，随着高通量基因和生物信息学发展，常见的高端文章要么是冷冻电镜解析一个结构（大爆发，华人学者一周内发表10篇CNS 主刊！），要么就是大批临床标本的大规模测序识别突变和表达信息（简讯：太牛了！测了2000多肿瘤样本的circRNA数据，怪不得发Cell！）。
实验技术越来越先进，实验思路越来越跨界，而做实验的学生们则越来越迷茫。
为此，本文尝试“温故而知新”，选取了一个最普通基础的主题：石蜡块，来做一次相关内容的汇总。
图源：网络一、组织石蜡块的准备与制作用于制作石蜡块的组织要新鲜，组织固定液为10%中性福尔马林，固定液体积最好为组织体积的10倍以上，如果低于5倍或者只是液体浸没组织，则会导致组织固定不充分，只是表面固定，内部组织随着时间会腐烂，影响结果。
经福尔马林固定的组织并不是能够长时间保存，需要在72小时内尽快完成石蜡块的包埋为最佳，以保证组织蛋白的表达结果不受实验偏倚影响。
如果不能在数天内完成下一步的石蜡块包埋，最好能在4度冰箱冷藏保存，而不宜常温保存。
石蜡块的包埋需要经过脱水和浸蜡。
脱水的质量好坏直径影响后期组织与蜡的相互融合。
此外，石蜡原材料的原则也是至关重要，面对不同的组织，需要动态调整石蜡成分，韧性高的实质组织，可以采用高熔点的石蜡块，而像肠壁和腺体等柔软的组织，可以选较低熔点的石蜡块。
此外，包埋石蜡块的底座平整与否直接影响了标本切片时的损耗。
所以，这里提醒一点：同样的石蜡块组织，可能由于石蜡块底部的坑洼，导致修片过程中大量的损耗了组织。
二、常用制作石蜡块途径（如果是大佬课题组，请直接跳过这段。
）1. 自制优点：几乎没有额外费用，即做即用。
缺点：国内大部分中小规模的实验室或者课题组并没有配套相应石蜡块制作设备。
2. 石蜡块制作外包的选择目前大部分的课题所需石蜡块均为外包途径。
而外包对象主要有两种：专门实验技术公司和大学基础医学病理相关的服务支持。
如何选择呢？专门公司制作石蜡块，第一速度快，毕竟以利益为驱动；第二服务好，一个电话，就可以像寄快递一样，足不出户，上门收货上门送货；第三具有服务行业的优点，除外可能威胁直接经济利益的，其他配套服务，比如提供咨询和配套材料均会免费，毕竟现在国内的专门实验技术公司尚处于市场开展阶段，没有浓重的官僚气或者垄断局面。
综述从石蜡包埋组织中提取DNA及对PCR的影响从多年存档的常规福尔马林固定－石蜡包埋病理标本中提取高质量DNA可以解决在短期内难以搜集到大量有用标本的难题。
但在福尔马林固定过程中常常出现DNA降解，不易获得大分子量DNA，使绝大多数分子生物学实验受限，因此从福尔马林固定－石蜡包埋组织中提取高质量DNA 可以解决分子生物学实验过程中缺少实验材料的难题，本节就不同的提取DNA的方法、标本固定过程对PCR模板的影响、DNA提取各步骤应注意的事项及如何获得满意的PCR扩增结果进行综述。
第一节、固定液、固定时间对DNA模板的影响DNA[1]。
Gall 等用6种固定液固定脑组织，它们分别为：①含缓冲液的10%的福尔马林；②1%多聚甲醛；③丙酮；④AMeX固定法；⑤Carnoy固定液；⑥Bouin固定液。
然后以相同的方法提取DNA，用于扩增317bp的β-肌纤蛋白基因。
发现第1、4、5种固定液中提取的DNA可以获得满意的扩增结果；而第2、3种固定液扩增效果较差；所有用第6种固定液固定的标本提取的DNA均未见特异性目的基因扩增条带[2]。
其他报道也证明：就固定组织中提取的模板质量及PCR有效扩增而言，甲醛固定优于多聚甲醛、B5及Bouin氏液[3-5]，含缓冲液的10%[6]，而用AmeX 方法固定，不仅能保护在福尔马林固定过程中破坏的抗原，而且可以提取到大分子量的DNA进行Southern杂交。
此外固定时间也明显影响DNA的提取质量。
Ohara等在室温下用市售的10%福尔马林溶液（终浓度为3.7%甲醛和1%甲醇）固定等量的MT-2细胞，时间分别为4小时、1、4、10天、1个月。
提取DNA后经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示：细胞固定时间少于4天的，可以见到较明显的大分子量条带；而固定超过4天仅见碎小片段[6]。
Roger10%福尔马林，将标本固定不同时间后（6、24、48、72小时、1、2、3、4周），提取DNA，用于C-K-ras基因（135bp）的扩增，发现：固定时间少于48小时，扩增效果无影响；固定72小时至1周，仅信号强度有些减弱；若超过1周则扩增效果明显减低[8]。
大量提dna的方法提取DNA是生物学和遗传学研究中的一项重要技术。
DNA提取的目的是将细胞中的DNA分离出来，方便进行后续的分析和研究。
下面将介绍几种常用的DNA提取方法。
一、酚/氯仿法酚/氯仿法是一种常用的DNA提取方法。
它利用酚和氯仿的不同密度来分离DNA和其他细胞组分。
首先，将细胞裂解，释放出DNA。
然后，加入酚和氯仿混合液，使DNA在两相溶液中选择性地分配。
最后，通过离心将DNA沉淀到底部，进一步清洗和纯化DNA。
二、石蜡包埋法石蜡包埋法主要用于从组织样本中提取DNA。
首先，将组织样本固定在甲醛中。
然后，经过脱水和浸渍处理，将组织样本置于石蜡中进行包埋。
接下来，用切片机切割出组织块，然后用蛋白酶和蛋白酶K进行消化，释放出DNA。
最后，通过离心等步骤分离和纯化DNA。
三、盐酸法盐酸法是一种简单快速的DNA提取方法，适用于从口腔黏膜等样本中提取DNA。
首先，将样本中的细胞裂解，释放出DNA。
然后，加入盐酸和乙醇，使DNA沉淀。
最后，通过离心将DNA沉淀到底部，进一步清洗和纯化DNA。
四、硅胶柱法硅胶柱法是一种高效的DNA提取方法。
它利用硅胶柱上的硅胶颗粒与DNA的亲和力，将DNA从其他细胞组分中分离出来。
首先，将细胞裂解，使DNA释放。
然后，将样品加载到硅胶柱上，通过洗涤和离心去除杂质。
最后，用低盐缓冲液洗脱DNA，获得纯净的DNA溶液。
五、磁珠法磁珠法是一种新兴的DNA提取方法。
它利用磁性珠子上的特殊配体与DNA的亲和力，将DNA从其他细胞组分中分离出来。
首先，将细胞裂解，使DNA释放。
然后，将磁性珠子加入到样品中，通过磁场将珠子与DNA结合，然后用洗涤缓冲液去除杂质。
最后，用低盐缓冲液洗脱DNA，获得纯净的DNA溶液。
DNA提取是生物学和遗传学研究中的重要步骤，不同的实验目的和样本类型适用于不同的DNA提取方法。
研究人员可以根据实际需求选择适合的DNA提取方法，以获得高质量的DNA样本，为后续的实验和研究提供可靠的基础。
·技术与方法·石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究江 炜,刘卫平△,李 雷,李甘地四川大学华西医院病理科(成都610041) 【摘要】 目的 改良石蜡组织DN A快速提取方法的流程,评价其提取效率,探讨其应用于病理诊断PCR分析的可行性。
方法 选取包括淋巴瘤及反应性病变的52例存档蜡块,以缓冲液煮沸方法快速提取DN A,并以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法作为对照,采用PCR反应扩增看家基因U-Globin以确定模板DN A质量,并通过测序确定结果的可靠性;同时根据临床病理诊断选择性的进行免疫球蛋白重链基因(I g H)或T细胞受体γ基因(TCR V)重排检测。
结果 快速法提取DN A的浓度虽低于对照方法,但U-Globin扩增效率与对照方法相比差异没有统计学意义(P>0. 05),对I g H和TC R V重排的检出率与对照相比差异亦没有统计学意义(P均>0.05)。
测序结果显示扩增片段与目的基因序列完全符合。
DN A可在-20℃保存至少4周。
结论 快速DN A提取法可以从存档的石蜡包埋组织中提供足量的PCR反应模板,结果稳定可靠,且省时省力,在病理诊断PCR分析中具有应用价值。
【关键词】 石蜡包埋 DN A提取 PCR 淋巴瘤【中图分类号】 R331,R733Rapid D NA Extraction f rom Archival Paraf f in-embedded Tissue:A Modif ied Method Available to PC R Analysisfor Diagnostic Pathology J I AN G Wei,L I U Wei-ping△,L I Lei,L I Gan-di. Department of Pathology,West China Hospital,Sichuan Univ ersity,Chengdu610041,China【Abstract】 Objective To modify a me tho d fo r rapid DN A ex traction fr om par affin-embedded tissue and toev a luate its efficie ncy and fea sibility av ailable to the PCR analysis fo r the diag nostic pa tho lo g y.Methods Ra pid DN A ex tra ctio n by simply boiling w as perfo r med on52ar chiv al par affin-em bedded tissues including ly mpho ma andr eac tiv e hy pe rplasia.The traditional phenol-chlor ofo rm a nd DN easy mini kit m etho ds w er e also used as contr ols. The DN A quality w as co nfir med by P CR am plifica tion o f ho usekeeping gene U-Globin.The accuracy of targ et frag ment w as reco nfirmed by sequencing a na ly sis.Ba sed o n the clinical pa thologic diag no sis to diseases,th e I g H and TCR V g ene w ere selected for their g ene rear rang ements detected.Results The amplification efficiency of U-G lo bin and the detectiv e ra te o f Ig H and T CR V g ene rear ra ng ements show ed no sta tistic significa nce betw ee n ra pid method and the co ntro ls,although a n obvious lo we r DN A co ncentra tio n ex trac ted by rapid method was sho w ed by spect ropho tomete r.The sequencing r esult o f PCR pro duct was tho ro ughly co nsistent w ith the DN A sequence ofcor responding ta rg et ge ne.The DN A in ex tract could be sto red a t-20℃fo r a t least4weeks.Conclusion Thera pid method o f DN A ex tracted fr om archiv al para ffin-embedded tissue can pr ovide enough DN A serv ed as PC R templa te,a nd be r eg ar ded a s a r elia ble,stable and eco no mical m etho d with pro spect in being used to PCR analysisfo r the diag no stic pa tholog y.【Key words】 Para ffin-embedded DN A ex tr actio n PCR Lym pho ma DN A提取是分子生物学研究的一种基础技术,其提取质量的好坏及数量的多少将直接影响到所有以DN A为研究对象的分子生物学实验。
石蜡块可以做常规PCR一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。
Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
Goelz氏DNA提取方法的主要步骤.切除多余石错，暴露组织.将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h ＴＥ９提取液的制备500mmol/L Tris20mmol/L EDTA10mmol/L NaCl1％SDS500 μg/ml 蛋白酶ＫpH8.04.再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h；5.用等体积酚－氯仿溶液抽提３次；6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA7.-70℃放置２－４h8.9 000xg离心１h9.沉淀物用70％乙醇洗１次0.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。
不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。
Southern 印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。
石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测价值评价摘要目的探讨分析石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测的价值。
方法63份经石蜡包埋的组织，随机分为实验组（32份）和对照组（31份）。
实验组采用DNA快速提取法，对照组采用试剂盒DNA提取法。
分别对两组提取出的DNA进行对比分析。
结果实验组在小组织标本中提取DNA的浓度及纯度均低于对照组；实验组在大组织标本中提取DNA的浓度及纯度与对照组比较无显著差异。
对照组中提取的DNA扩增后可达到500 bp以上，实验组扩增产物则在400 bp以上。
结论分子病理检测中应用石蜡包埋组织DNA快速提取法，可在保证质量的情况下，大大缩短检测时间，提高检测安全性，临床上值得应用。
关键词分子病理检测；石蜡包埋组织；DNA快速提取法；价值近年来，随着分子病理学的不断发展，人们对肿瘤疾病的认识与研究不再局限于患者的器官、细胞，而是延伸到了蛋白质、DNA等水平。
分子病理学使病理诊断变得更加准确、客观，而且在肿瘤的治疗及预后等方面也有着重要价值，其中免疫检测、基因检测、流式细胞术等技术目前应用较为广范，全面推动着医疗技术的发展[1]。
提取DNA是分子病理检测的重要内容，本研究通过对石蜡包埋组织进行DNA提取、分析，旨在评价石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测中的价值，现报告如下。
1 材料与方法1. 1 材料选取2016年3～12月经石蜡包埋的组织63份，将其随机分为实验组（32份）和对照组（31份）。
所有标本均使用中性甲醛固定，其中淋巴结、肿瘤、宫颈组织各21份。
1. 2 方法1. 2. 1 实验组采用DNA快速提取法，对每例标本制作4张蜡片，首先将蜡片置入离心管中并加入裂解液，采用金属浴方法将石蜡溶解，并将温度控制在95℃，持续时间在10 min左右，然后以14000 r/min对其进行离心操作，离心过程持续5 min，最后将蜡层下出现的清凉溶液置于-20℃环境下保存。
![一种石蜡DNA纯化方法及其在基因组学中的应用[发明专利]](https://uimg.taocdn.com/fd3c7333b42acfc789eb172ded630b1c58ee9b7e.webp)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510818823.X (22)申请日 2015.11.23C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)(71)申请人中国科学院北京基因组研究所地址100101 北京市朝阳区北辰西路1号院104号楼(72)发明人陈科 慈维敏(74)专利代理机构北京中政联科专利代理事务所(普通合伙) 11489代理人刘玉玲(54)发明名称一种石蜡DNA 纯化方法及其在基因组学中的应用(57)摘要本发明提供一种石蜡包埋样本中的DNA 提纯方法，所述方法包括(1)对样本进行脱蜡；(2)去除样本中的甲醛；(3)细胞裂解；(4)提取DNA ；(5)去除DNA 与蛋白质的粘连；(6)纯化DNA，其中，所述步骤(1)包括用二甲苯对样本进行脱蜡。
利用本发明的方法得到的DNA 纯度高，测序质量接近于新鲜组织的DNA 样本。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 105274090 A 2016.01.27C N 105274090A1.一种石蜡包埋样本中的DNA提纯方法，所述方法包括(1)对样本进行脱蜡；(2)去除样本中的甲醛；(3)细胞裂解；(4)提取DNA；(5)去除DNA与蛋白质的粘连；(6)纯化DNA，其特征在于，所述步骤(1)包括用二甲苯对样本进行脱蜡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述所述步骤(1)中，重复多次用二甲苯对样本进行脱蜡。
3.如权利要求1-2任一的方法，其特征在于，所述步骤(2)中包括使用硼氢化钠将甲醛还原为甲醇。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述硼氢化钠的浓度为0.1-1.0M。
5.如权利要求1-4任一的方法，其特征在于，所述步骤(5)中包括使用去交联剂以去除DNA与蛋白质的粘连。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中还包括联合使用蛋白酶K以去除DNA与蛋白质的粘连。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 中国人类遗传资源疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程Technical Specification for the Paraffin Imbedding Tissue Collection and Trimming and Preservationof Chinese Disease Genetic Resources（讨论稿）中国人类遗传资源平台项目组2005年9月w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 前 言石蜡有适当硬度，包埋组织能够常规制备成36微米厚度的切片用于诊断和研究。
由于石蜡包埋组织能够较长时间地保存组织内的蛋白质和核酸，用石蜡包埋固定好的人类疾病组织制作成切片，可用于HE染色分析（通过镜下观察，做出临床病理诊断）、DNA 及RNA的原位杂交分析、蛋白质分析、核酸提取用于病原微生物的诊断或其它分子生物学诊断及研究等。
故规范性地作好石蜡包埋组织、提供适宜的蜡块储存环境、严格培训蜡块保管人员，以及明确蜡块管理使用程序非常重要。
目前，我国尚无关于人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存工作的国家标准，为使我国相关工作有章可循，规范操作和管理，我们根据目前的研究积累，参考国际相关做法，同时结合中国国情，制定本规程。
w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 目 次前 言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡 (2)4.1 取材 (2)4.2 洗涤 (2)4.3 脱水 (2)4.4 透明 (3)4.5 浸蜡 (4)5 组织包埋 (5)6 切片、展片及烤片 (6)7 染色 (7)8 封片 (8)9.1 蜡块存放环境 (8)9.2 蜡块存放温度 (8)10 保管人员的资格及要求 (9)11 蜡块使用的范围 (9)12 蜡块的医疗安全规范 (9)参 考 文 献 (11)w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程1 范围本规程适用于与人体疾病石蜡包埋组织标本相关的诊断、医学及司法鉴定、科研操作，因此在医院、司法机关和科研单位应规范执行。
石蜡切片DNA提取方法的改良及其临床应用
张素娟;赵彤
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】1996(012)004
【摘要】石蜡切片ＤＮＡ提取方法的改良及其临床应用张素娟，赵彤，董敬朋，赵菲，邱红明，朱梅刚从石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ，用于ＰＣＲ技术进行基因检测，国内外多采用切５～１０μｍ厚石蜡切片５～１０张装入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，经脱蜡，离心，再进行ＤＮＡ提取。
本室改...
【总页数】2页(P363-364)
【作者】张素娟;赵彤
【作者单位】第一军医大学病理学教研室;第一军医大学病理学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R361.2
【相关文献】
1.改良石蜡切片DNA提取法在检测人乳头瘤病毒中的应用 [J], 戴小波;黄志勇
2.改良性速石蜡切片技术的临床应用及体会 [J], 范远芳;黄霞
3.小麦HMW-GS分子检测中DNA提取方法的改良 [J], 张婷婷;庞冰;董永军;裴成成;牛学谦;王陆军;郝建平;王艳梅;王创云;李培良;邓艳芳;周琼;李志敏
4.黑曲霉Aspergillus niger全基因组DNA提取方法的改良与比较 [J], 蔡程山; 王雨; 白飞荣; 翟磊; 张天赐; 胡海蓉; 姚粟
5.一种改良的旱地土壤微生物DNA提取方法 [J], 胡娴; 彭涛; 王逗; 侯海军; 秦红灵; 陈香碧; 陈春兰
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石蜡包埋组织的DNA提取及其应用近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组D NA的变化积累了新资料。
目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。
在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。
通过对DNA或m RNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。
Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。
Goelz 等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。
Du beau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。
Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DN A之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤8．9000×g离心1h9．沉淀物用70%乙醇洗1次10．干燥，TE（pH7.2）溶解。
表18-6 TE9 DNA提取液的制备500mmol/L Tris20mmol/L EDTA10mmoo/L NaCl1% SDS500μg/ml蛋白酶KPH8.05μm组织切片↓常规脱蜡、水化↓第一次溶液A孵育（去上清）↓第二次溶液A孵育（留上清）↓氯仿-异戊醇抽提↓RNA酶和蛋白酶消化↓酚抽提↓沉淀↓（却除未螺旋化DNA）↓透析图18-6石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等，1986）溶液A2×SSC100μg 蛋白酶K/ml1% SDS不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。
Southern印迹杂交分析需要10～15μg大片段D NA（＞20kb），因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。
故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。
与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。
PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。
这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h，DNA即可释放出来。
此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且重复性不好。
这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。
二、影响DNA提取质量的因素1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。
目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。
Warford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。
DNA提取过程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。
bramwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DN A明显降解。
Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量明显降低。
Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）处理标本不能获得完整的DNA。
乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。
Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。
每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本（19.4μg/mm3）。
经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带，说明DNA被完成消化。
Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。
Sato 等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无损。
其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至-20℃过夜。
然而再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2～3h，石蜡包埋。
结果显示，每10mg AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4±13.76μg）。
酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。
提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DN A减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。
2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。
这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。
如果事实果真如此，那么固定的时间是一个重要的变异因素。
然而，Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。
Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA 的降解。
该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。
固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。
Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30%，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。
根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110之内。
3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。
室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时，产生两条单链分子。
在此变性状态下，甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。
最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。
通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。
酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。
一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变。
当pH达到2.5以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N-糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最后，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。
上述改变亦受温度或离子强度的影响。
加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。
然而，即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。
福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。
4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之间，主要分布于100～1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。
这除与固定剂、固定时间等因素有关外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。
当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的时间长短不一。
虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获得的DNA分子量大。
可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。
组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA变性，而产生单链DNA片段。
单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。
三、提高DNA提取质量的方法1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。
因此，在DNA提取前应检查组织切片。
如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。
尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。
2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们从不同方面进行了探索。
其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化时间和DNA纯化等问题上取得了进展。
①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。
固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DAN与蛋白质不易分离。
因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可达1mg/ml；作用时间一般为2～4天，最长可达7天。
蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。
Koshiba等发现，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能够得到令人满意的完整DNA。
尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2-巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。
