多种酶体系用于肽类药物体外代谢性质的研究

多种酶体系用于肽类药物体外代谢性质的研究孙会仙 陈 佳 张淑珍 郭 磊 廖 沙 谢剑纬＊ 刘克良军事医学科学院毒物药物研究所 北京100850摘 要 应用反相高效液相色谱法 RP -H P L C 对肽类药物促黄体激素释放激素 L H R H 醋酸亮丙瑞林 L e r o r e i i n A c e t a t e T A P -144-SR 和新药L X T 101在6种酶体系中的体外代谢性质进行了研究 流动相采用梯度或等度洗脱 L H R H T A P -144-SR 的检测波长为216nm L X T 101的检测波长为225nm 采用液相色谱-电喷雾质谱 LC -E SI -M S 联用技术对其酶解片段进行了鉴定 L H R H T A P -144-SR 和L X T 101的浓度在4.0~400m g /L 范围内与其峰面积呈良好线性关系 r >0.9990 在糜蛋白酶 胰蛋白酶 胃蛋白酶和胰混合酶中的绝对回收率为95.0%~98.7% 在血浆和肝匀浆中的绝对回收率为60.0%~71.0% 日内相对标准偏差 R SD <1.5% 日间R SD<2.5% 半衰期 t 1/2 为L X T -101>T A P -144-SR>L H R H 质谱鉴定表明 L H R H 容易在3-4 5-6位发生断裂 T A P -144-SR 容易在3-4位发生断裂 选择的酶体系可用于评价多肽药物的体外代谢性质关键词 肽类药物 反相高效液相色谱 液相色谱-电喷雾质谱 体外酶体系 半衰期2005-12-16收稿 2006-04-25接受本文系国家自然科学基金 No .30500629 与北京市科委基础研究基金 N o .Z 0005187040531 资助项目1 引 言肽类药物具有剂量低 毒副作用小等特点 近年来已被越来越多地应用于临床治疗各种疾病 但由于其在体内各种酶的作用下可快速降解 1导致生物利用度低 半衰期短 从而不利于临床用药治疗 因此寻找体内半衰期长 生物利用度高的生物活性长效肽成为多肽药物研究的重点 文献曾报道采用与酶抑制剂联合用药2 3非天然氨基酸置换天然氨基酸 4 5 以及N C 端的修饰 2 等方式 可以延长肽类药物在体内的生物活性促黄体激素释放激素 LH R H 是一种含有10个氨基酸的小分子肽 可以促使卵泡刺激素 F SH 和促黄体生成素 L H 的释放 6 从而用于治疗与此类激素相关的一些疾病 如子宫内膜异位症 前列腺癌等7 8但由于其在体内各种酶的作用下可快速降解 从而不利于临床用药治疗 为了延长其在体内的半衰期 国外在LH R H 的结构基础上经过改造修饰得到醋酸亮丙瑞林 i e r o r e i i n a c e t a t e T A P -144-SR 已成功应用于临床治疗与性激素相关的一些疾病 L H R H T A P -144-SR 及L X T 101的氨基酸序列如下L H R H i -H i s -T r -Se r -T r - i -L e -A r g -P r o - i -N H 2T A P -144-SR i -H i s -T r -Se r -T r -D -L e -L e -A r g -P r o -N H -C H 2-C H 3 X H A c L X T 101A c -D -N a i -D -C a -D -P he -Se r -A r g -D -P a i -L e -A r g -P r o -D -A i a -N H 2本实验拟通过建立各种体外代谢酶体系 开展LH R H 及其结构修饰物T A P -144-SR L X T 101在不同体外代谢酶体系中的代谢性质的比较研究 为研发长效高活性肽类药物提供重要信息 并采用液相色谱-电喷雾质谱 LC -E SI -M S 联用技术对其酶解片段进行鉴定 了解不同酶体系中肽类药物易于断裂的位点 为进一步通过结构改造研发长效 高活性的肽类药物提供有价值的数据2 实验部分2.1 仪器与试剂1100型高效液相色谱仪 美国A g i i e nt 公司 带自动进样器 DA D 紫外检测器 C he m St a t i o n 化学工作站 Mi c r o m a s s L C T 电喷雾飞行时间质谱仪 2690型高效液相色谱仪 美国W a t e r s 公司 电热恒温水第34卷2006年9月分析化学 FE N X I H U A X U E 研究报告C hi ne s e J o r na i o f A na i t i c a i C he m i s t r特刊S54~S58浴锅北京西城区医疗器械厂);S e c t r a f g e16M高速离卜机美国L a9ne t公司);F-11酸度计北京屹源电子仪器科技公司);Sa r t o r i s半微量电子天平德国Sa r t o r i s公司);真空浓缩离卜机美国L A B C O N C O公司) 肽类药物L H R H~T A P-144-SR和L X T101军}医学科学院毒物药物研究所合成纯度>98.0%);牛糜蛋白酶50/m g)~牛胰蛋白酶14600/m g)~猪胃蛋白酶3660/m g)和猪胰混合酶8X U SP主要成分为胰蛋白酶~糜蛋白酶~胰淀粉酶和胰脂肪酶)Si g m a公司);乙睛H P L C纯F i s he r公司);三氟乙酸T F A A c r o s公司);醋酸按和冰醋酸等均为国产分析纯;实验用水为去离子-亚沸二次蒸馏水2.2 实验方法2.2.1 配制实验用酶溶液0.08g/L糜蛋白酶T r i s-H C i0.05m o i/L H=8.1)溶液0.50g/L胰蛋白酶T r i s-H C i0.05m o i/L H=8.1)溶液0.15g/L胃蛋白酶T r i s-H C i0.02m o i/L H=2.0)溶液1.2g/L胰混合酶P B S等渗溶液饱和);制备大鼠肝匀浆1g I4m L的P B S等渗缓冲液);人新鲜冷冻血浆购自解放军307医院2.2.2 色谱条件色谱柱Z O B A XSB-C182.1m mX150m m5-m) X D B-C8预柱 2.1m mX12.5 m m5-m);柱温25C;检测波长L H R H~T A P-144-SR为216nm L X T101为225nm;进样量5-L;流速0.2m L/m i n;流动相A为乙睛0.01m o i/LN H4A c=10I90 H=5.0H A c调);流动相B为乙睛0.01m o i/LN H4A c=40I60 H=5.0H A c调);L H R H~T A P-144-SR的梯度条件为0~4.5m i n95%A 5%B;4.5~20m i n A95%~10%B5%~90%;20m i n~25m i n10%A90%B;25.1~40m i n95%A 5%B;L X T101等度条件10%A90%B2.2.3 质谱工作参数毛细管电压3000V样品锥孔电压10V抽取锥孔电压5V;源温120C脱溶剂温度350C;脱溶剂气流350L/h2.2.4 不同酶体系的体外代谢实验糜蛋白酶体系0.2g/L样品水溶液与糜蛋白酶溶液各100-L 于离卜管中放置37C水浴中孵育不同时间取出10%T F A10-L终止反应高速离卜10000r/m i n 10m i n) 取上清液直接进行H P L C分析0.2g/L样品水溶液与胃蛋白酶~胰蛋白酶和胰混合酶的处理方法同上肝匀浆体系0.2g/L样品水溶液与肝匀浆各100-L于离卜管中放置37C水浴中孵育不同时间取出加200-L乙睛沉淀蛋白终止反应涡旋振荡1m i n高速离卜10000r/m i n10m i n) 取出上清液真空离卜浓缩至干残渣用100-LH2O溶解涡旋振荡1m i n高速离卜10000r/m i n 10m i n) 取上清液直接进行H P L C分析0.2g/L样品水溶液与血浆的处理方法同肝匀浆体系3 结果与讨论3.1 方法学考察准确称取L H R H~T A P-144-SR和L X T101标准品各4m g用水溶解定容至10m L制成0.4g/L的标准储备液精确吸取标准储备液适量并逐级稀释使其浓度分别为400~200~100~50.0~10.0~5.0~2.5~ 1.0m g/L按2.2.2所述色谱条件分别进样5-L测定峰面积以峰面积Y)对样品浓度X m g/L)进行线性回归分析L H R H~T A P-144-SR和L X T101三种肽类药物的线性范围为4.0~400m g/L L H R H~ T A P-144-SR以及L X T101三者的检出限分别为1.00m g/L~1.00m g/L~2.50m g/L其线性方程和回归系数见表1表1 标准曲线方程~相关系数及精密度Z=5)T a9i e1 T he i i ne a r e g a t i o ns c o r r e c t i o n c o e f f i c i e nt s r)a nd r e c i s i o ns多肽P e t i de s标准曲线L i ne a r e g a t i o ns r日内精密度%)I nt r a-da r e c i s i o n低L o w中M i ddi e高H i g h日间精密度%)I nt e r-da r e c i s i o n低L o w中M i ddi e高H i g hL H R H Y=34298X-32.480.99920.850.170.11 1.570.950.56 T A P-144-SR Y=33757X-121.220.9998 1.260.260.12 2.25 1.230.98 L X T101Y=60944X-251.790.9999 1.010.840.26 2.14 1.460.85L H R H i t e i ni Z i ng ho r m o ne r e i e a s i ng ho r m o ne;T A P-144-SR i e r o r e i i n a c e t a t e;L X T101L Ha nt a g o ni s t.55特刊孙会仙等多种酶体系用于肽类药物体外代谢性质的研究在一天内对浓度分别为200\50.0和10.0m g /L 的L H R H \T A P -144-SR 和L X T 101的标准溶液进行测定a 每份样品重复5次a 求得日内精密度;每天各测定一份样品a 连测5d a 计算日间精密度(见表1)O图1 T A P -144-SR 在胰蛋白酶体系中酶解色谱图Fi g .1 C hr o m a t o g r a m s o f T A P -144-SRa nd i t s de g r a -t i o n r o d c t s i n t r s i n s s t e m峰1是1~3氨基酸肽段a 峰2是4~9氨基酸肽段a 峰3是TA P -144-SR 的主峰( e a k 1a 2a nd 3a r eT A P -144-SR (1~3)a T A P -144-SR (4~9)a nd T A P -144-SR i t s e i f a r e s e c t i v e i )O比较水\6种空白酶体系与分别加有肽类药物L H R H \TA P -144-SR 和L X T 101的糜蛋白酶溶液\胰蛋白酶溶液\胃蛋白酶溶液\胰混合酶溶液\肝匀浆和血浆的高效液相色谱图a 结果表明a 6种酶体系的内源性杂质不干扰待测组分的测定(胰蛋白酶体系的结果见图1)O 3.2 酶体系失活及样品提取方法的选择分别选用煮沸\添加乙睛或10%TF A 水溶液(V /V )等方法终止酶活性并沉淀蛋白O 结果表明a 选用添加10%T F A 溶液终止糜蛋白酶\胰蛋白酶\胃蛋白酶和胰混合酶的活性并沉淀蛋白[9a 10]a 样品的绝对回收率为95.0%~98.7%O 而采用煮沸失活法a 样品的绝对回收率<65.0%O 所以选择添加10%T F A 溶液终止4种酶体系活性并沉淀体系中蛋白质O 但对于肝匀浆和血浆则不能选用10%TF A 终止酶活性并沉淀蛋白a 因为10%T F A 沉淀肝匀浆和血浆中的蛋白不完全a 导致L C分析时柱压升高O 选用简单的煮沸法去除血浆及肝匀浆中蛋白的方法a 样品的绝对回收率<4.80%O 而选用不同比例的乙睛沉淀法去除蛋白a 体系中添加两借量体积的乙睛时a 样品的绝对回收率最高a 为60.0%~71.0%a 且去除蛋白质较完全O 所以选择添加两借量体积的乙睛处理血浆及肝匀浆样品O3.3 L H R H #T A P -144-S R 和L X T -101在6种酶体系的体外代谢结果肽类药物L H R H \T A P -144-SR 和L X T 101在6种酶体系的药时曲线可用一室模型拟合a 统计分析及曲线拟合使用O r i g i n 5.0软件a 求取t 1/2的结果见表2O 由表2可知肝匀浆和胰混合酶体系对3种肽类药物代谢均较快a 其中胰混合酶体系中代谢速度最快a 而血浆中代谢速度最慢O 糜蛋白酶对L H R H \T A P -144-SR 的代谢较快a 但对L X T 101的代谢较慢O 通过L H R H \T A P -144-SR 和L X T 101在6种酶体系中半衰期的比较a 得知t 1/2(L X T -101)>t 1/2(T A P -144-SR )>t 1/2(L H R H )a 与预期的实验设计目的相符a 表示选择的酶体系可用于评价多肽药物的体外代谢性质O表2 3种肽类药物在不同酶体系中的t 1/2T a 9i e 2 H a i f -i i f e (t 1/2)of t hr e e e t i de drg s i n v a r i o s e nZ m a t i c s s t e m s 药物D r g 糜蛋白酶C h m o t r s i n胃蛋白酶P e s i n 胰蛋白酶T r s i n 胰混合酶P a nc r e a t i n肝匀浆L i v e r ho m o g e na t e血浆P i a s m a L H R H 1.0 5.6 0.02711.2T A P -144-SR 16 6.00.00450.46>50L X T -101>21>24>210.365.4>88i 代表代谢速度太快a 无法求取t 1/2(deg r a da t i o n r a t e i s t o o f a s t t o 9e o 9t a i ne d )O L H R H \T A P -144-SR 经糜蛋白酶\胃蛋白酶及胰蛋白酶37C 水浴中孵育不同时间后a 从色谱图中观察到主峰逐渐降低并伴随着碎片峰的逐渐升高a 但LX T -101在同样条件下未观察到酶解片段a 甚至在酶解21h 后也未观察到碎片峰的产生a 图1即为TA P -144-SR 与胰蛋白白酶的体外代谢色谱图;在37C 水浴中3种肽类药物与血浆孵育不同时间后a 色谱图中只有LH R H 可观察到主峰的逐渐下降并伴随着碎片峰的产生a TA P -144-SR \L X T -101与血浆孵育50h a 主峰没有明显的降低;与胰混合酶及肝匀浆在37C 水浴中孵育不同时间a 从色谱图中均可观察到主峰的逐渐下降并伴随着碎片峰的产生O3.4 L H R H 和T A P -144-S R 在5种体外酶体系中代谢产物的L C -E S I - S 鉴定通常胰蛋白酶的酶切位点为精氨酸\赖氨酸等碱性氨基酸;糜蛋白酶的酶切位点为苯丙氨酸\酪氨酸等芳香氨基酸;胃蛋白酶的酶切位点为芳香氨基酸\疏水氨基酸O 采用LC -E SI -M S 技术分别对L H R H 65分析化学第34卷图2 T A P -144-SR 在胰蛋白酶中酶解产物的总离子流图F i g .2 T o t a i i o n c hr o m a t o g r a m T I C f o r T A P -144-SR a nd i t sm e t a 9o i i t e s i n t r s i n s s t e m m /z 453是1~3氨基酸肽段加氢峰 m /z 776是4~9氨基酸肽段加氢峰 m /z 1210是T A P -144加氢峰 m /z o f 453 776a nd 1210a r e T A P -144-SR 1~3a a +H + 4~9a a +H +a nd T A P -144+H+ r e s e c -t i v e i和TA P -144-SR 在5种体外酶体系中的代谢产物进行鉴定 见表3 结果表明肽类药物除了在相应的酶切位点酶解外还发现其它的代谢片段 有的代谢片段在质谱上没有得到归属 综合分析实验结果表明LH R H 的代谢产物主要为3-4 5-6位断裂后形成的3个肽段 其中m /z 269.5是4-5氨基酸肽段加氢峰 m /z499.0是6~10氨基酸肽段加氢峰 m /z 453.7是1~3氨基酸肽段加氢峰 m /z 1184.4是L H R H 原型加氢峰 T A P -144-SR 的代谢产物主要为在3-4位断裂后形成的2个肽段 m /z 453.7是1-3氨基酸肽段加氢峰 m /z 491是1~3氨基酸肽段的加钾峰 m /z 776.5是4~9氨基酸肽段加氢峰 m /z 1210是亮丙瑞林 TA P -144 加氢峰 图2是T A P -144-SR 在胰蛋白酶体系中代谢产物的LC -E SI -M S 鉴定图 表3 LH R H 和T A P -144-SR 在5种体外酶体系中代谢产物的L C -E SI -M S 鉴定结果T a 9i e 3 I Z U i t r O de g r a da t i o n r o d c t s o f L H R Ha nd T A P -144-SRi n f i v e e nZ m a t i c s s t e m s 9 i i g i d c hr o m a t o g r a h -e i e c t r o s - r a i o ni Z a t i o n m a s s s e c t r o m e t r LC -E SI -M S 多肽药物P e t i de dr g s 代谢模型M e t a 9o i i s mm o de i s 代谢产物保留时间 t R Re t e nt i o n t i m e of deg r a da t i o n r o d c t s 4~5a a +H +m /z 269.51~3a a +H +m /z 453.76~10a a +H +m /z 499.04~9a a +H +m /z 776.5m /z 1184 1210L H R H糜蛋白酶Ch m o t r s i n 4.377.3115.7416.8＊胃蛋白酶P e s i n 7.359.84＊15.7316.5＊19.98胰蛋白酶T r s i n 7.329.59＊15.49 19.35胰混合酶Pa nc r e a t i n 4.357.29 肝匀浆Li v e r ho m o g e na t e 4.377.2815.8016.5＊19.57T A P -144-SR糜蛋白酶C h m o t r s i n 7.3721.32 胃蛋白酶P e s i n 7.3321.34 24.95胰蛋白酶T r s i n 6.9721.3022.4＊25.09胰混合酶Pa nc r e a t i n 4.367.3720.62 24.08肝匀浆Li v e r ho m o g e na t e 4.357.3521.3622.1＊24.47＊ 在L C -E SI -M S 上没有得到归属 e a ks a r e no t i de nt i f i e d 9 L C -E SI -M S 无此峰 e a ks a r e no t f o nd4 L O建立了糜蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 胰混合酶 肝匀浆和血浆6种用于评价肽类药物L H R H T A P -144-SR 和L X T -101的体外代谢模型 结果表明胰混合酶对选定的肽类药物代谢最快 血浆代谢最慢 通过3个药物在6种体外酶体系的t 1/2比较 t 1/2 L X T -101 >t 1/2 T A P -144-SR >t 1/2 LH R H 达到了结构修饰的目的 并且表明选择的酶体系可用于评价多肽药物的体外代谢性质 采用LC -E SI -M S 技术对其酶解片段进行鉴定 结果表明 LH R H 在3-4 5-6位易断裂为3个片段 与文献 1 3 5 11 12 报道L H R H 易在3-4 4-5 5-6位断裂相符 T A P -144-SR 在3-4位易断裂为两个片段 从而为进一步通过结构改造研发长效 高活性的肽类药物提供了有价值的数据 R e f e r e n c e s1 W o o di e J F .C r i t .R e U .T he r .D r ug 1994 11 2~3 61~952 P a i e t t i M a ng w a r S K ni T N e r r ka r M M O k m FW T a m r a K Si a ha a n TJ Bo r c ha r dt RT . .C O Zt r O l R e l e as e 1996 41 1~2 3~173 Y a ng XD R o j a na s a k i Y W a ng LY M a J YC M a J KH.P har m .R e s . 1998 15 9 1480~148475特 刊孙会仙等 多种酶体系用于肽类药物体外代谢性质的研究85分析化学第34卷4 K o m e i i a UB,D a ni BA.Li f e sc i.,1996,58(24>:2201~22075 H a n K,P a r k J S,C h ng YB,L e e M J,M o o n DC,R o9i ns o n J R.P har m.R e s.,1995,12(10>:1539~15446 H e r9s t KL.C ur r.O p i Z.P har m.,2003,3(6>:660~6667 St r i c ke r HJ..U r O l O gy,2001,58(2>:S24~S278 C o c c i a M E,C o m a r e t t o C,B r a c c o L,Sc a r s e i i i.E ur..O Z s t e t.C y Z.R.B.,2004,115(S1>:S44~S569 a i i w i t Z B,R o e t e r T,M o r s-W o r t m a nn C,M e nt i e i n R,Si e g e i E ,Sc hm i dt W E.R e gul.P e p t i de s,2000,86(1~3>:103~11110 Si e g e i E ,a i i w i t Z B,Sc ha r f,M e nt i e i n R,M o r s-W o r t a nn C,F o i s c h UR,Sc hr e Z e nm e i r J,D r e s c he r K,Sc hm i dt WE.R e gul.P e p t i de s,1999,79(2~3>:93~10211 W e n J Y,L e dg e r a R,M c L e o d BJ,D a v i e s NM,B t t A ,T c ke r I.Li f e sc i.,2002,71(25>:3019~303012 W e n J Y,D a v i e s N,L e dg e r R,B t t,M c i e o d B,T c ke r I.J.C hr O m at O gr.B-a Zal y t.T e c hZO l.B i O m e d.Li f e sc i.,2002,779(2>:221~227I nv i t r o e t ab ol i s m s of P e p t i d e d r u gs i nv ar i ou s E n z ym at i c S ys t e m sS n H i X i a n,C he n J i a,Z ha ng Sh Z he n, o L e i,L i a o Sha,X i e J i a nw e i＊,L i K e i i a ng(B e i j i Zg I Zs t i t ut e O f P har m ac O l O gy aZd T O x i c O l O gy,B e i j i Zg100850>A b s t r ac t R e v e r s e d ha s e hi g h e r f o r m a nc e i i g i d c hr o m a t o g r a h (R P-H P L C>m e t ho d w a s de v e i o e d t o i n-v e s t i g a t e a nd c o m a r e i Z U i t r O m e t a9o i i s m s o f i t e i ni Z i ng ho r m o ne r e i e a s i ng ho r m o ne(L H R H>,i e r o r e i i n a c e-t a t e(T A P-144-SR>a nd ne wdr g L Ha nt a g o ni s t(L X T101>i n s i X di f f e r e nt e nZ m a t i c s s t e m s.T he s e a r a t i o n o f e t i de dr g s a nd t he i r di g e s t e d f r a g m e nt s w a s a c hi e v e d9 g r a di e nt o r i s o c r a t i c e i t i o n r o g r a ma t216nm (f o r L H R Ha nd T A P-144-SR>o r225nm(f o r L X T101>.L i g i d c hr o m a t o g r a h -e i e c t r o s r a i o ni Z a t i o n m a s s s e c t r o m e t r(L C-E SI-M S>w a s s e d t oi de nt i f t hem e t a9o i i t e s o f L H R H,T A P-144-SR a nd L X T101.T he g o o d i i ne a r r a ng e i s4.0-400m g/L(r>0.9990>f o r L H R H,T A P-144-SRa nd L X T101.T he r e c o v e r i e s o f t hr e e e t i de dr g s r a ng e d f r o m95.0%t o98.7%i n c h m o t r s i n,t r s i n, e s i n a nd a nc r e a t i n s s t e m s,60.0%t o71.0%i n i i v e r ho m o g e na t e a nd i a s m a.T he R SD s o f i nt r a-da a nd i nt e r-da w e r e i e s s t ha n1.5%a nd2.5%,r e s e c t i v e i.T he o r de r o f di g e s t e d ha i f-i i f e o f t he t hr e e e t i de dr g s w a s L X T101>T A P-144-SR >L H R H.T he r e s i t s o9t a i ne d9 L C-E SI-M S i ndi c a t e d 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Liao Sha， Xie Jianwei， Liu Keliang作者单位：军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850刊名：分析化学英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY年，卷(期)：2006,34(z1)1.Woodley J F查看详情 1994(2-3)2.Pauletti G M;Gangwar S;Knipp G T;Nerurkar M M Okumu F W Tamura K iahaan T J Borchardt R T查看详情 1996(1-2)3.Yang X D;Rojanasakul Y;Wang L Y;Ma J Y C Ma J K H Enzymatic degradation of luteinizing hormone releasing hormone (LHRH)/(D-Ala6)-LHRH in lung pneumocytes.[外文期刊] 1998(09)4.Kompella U B;Dani B A查看详情[外文期刊] 1996(24)5.Han K;Park J S;Chung Y B;Lee M J Moon D C Robinson J R查看详情 1995(10)6.Herbst K L查看详情 2003(06)7.Stricker H J查看详情[外文期刊] 2001(02)8.Coccia M E;Comparetto C;Bracco G L;carselli G查看详情 2004(z1)9.Gallwitz B;Ropeter T;Morys-Wortmann C;Mentlein R iegel E G chmidt W E查看详情[外文期刊]2000(1-3)10.Siegel E G;Gallwitz B;charf G;Mentlein R Morys-Wortann C Folsch U R chrezenmeir J Drescher K chmidt W E查看详情[外文期刊] 1999(2-3)11.Wen J Y;Ledgera R;McLeod B J;Davies N M Butt A G Tucker I G查看详情[外文期刊] 2002(25)12.Wen J Y;Davies N;Ledger R;Butt G,Mcleod B,Tucker I G查看详情 2002(02)本文链接：/Periodical_fxhx2006z1013.aspx。