重组蛋白的表达系统(详细版)

Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，用于原核和真核表达重组蛋白。

它们都包含了两个不同的多克隆位点，可以用于插入感兴趣的基因并进行表达。

Petduet1使用了T7和lacUV5启动子，pacycduet则使用了T7和CMV启动子。

以下是关于这两种系统的详细介绍：Petduet1和pacycduet系统的结构Petduet1和pacycduet系统的DNA载体结构大体相似，都包括了多个重要元件：双选择标记位点（Ampicillin和Chloramphenicol）、启动子（T7和lacUV5/CMV）、His标签、HA标签、TEV位点、定向载体和复制起点等。

Petduet1由5429bp长的质粒构成，其中含有lacIq基因的启动子和T7启动子，并通过MCS1和MCS2多克隆位点构建了重组基因组成，方便插入两个不同的重组蛋白基因。

Petduet1还包含了His标签和HA标签，对于蛋白的纯化和检测非常有帮助。

Pacycduet的质粒长度为5726bp，包含了Ampicillin和Chloramphenicol的双选择标记位点，T7和CMV的启动子，His标签和HA标签。

与Petduet1类似，pacycduet也有MCS1和MCS2多克隆位点，方便插入两个感兴趣的基因。

pacycduet还包含了TEV位点，方便进行蛋白纯化和切割。

Petduet1和pacycduet系统的应用这两种双元表达系统可以广泛应用于原核和真核系统中，用于表达多种蛋白。

研究表明，它们不仅可以同时表达两个重组蛋白，而且还可以在同一细胞中进行蛋白融合。

在原核表达系统中，Petduet1和pacycduet系统可以在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，提供了一种简单、快速的蛋白制备方法。

而在真核表达系统中，它们同样可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，为疾病治疗和生物医药领域提供了重要的工具。

总结Petduet1和pacycduet是两种常用的双元表达系统，具有结构简单、应用广泛的特点。

细菌发酵生产重组蛋白的科学方法引言：细菌发酵生产重组蛋白是一种生物技术方法，可以用于大规模生产潜在的药物和工业用途的重组蛋白。

本文将介绍细菌发酵生产重组蛋白的科学方法，主要包括蛋白表达系统的选择、基因工程的构建和发酵过程的优化。

通过这些方法，可以有效地提高重组蛋白的产量和纯度，为临床和工业应用提供可靠的生产方法。

一、蛋白表达系统的选择在细菌中表达重组蛋白，需要选择适合的蛋白表达系统。

常用的细菌蛋白表达系统包括大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统。

大肠杆菌表达系统是最常用的表达系统之一，具有高效、易于操作和便宜的特点。

毕赤酵母表达系统则适用于复杂蛋白的表达，能够产生高产量的重组蛋白。

选择蛋白表达系统时，需要考虑到目标蛋白的特性和需求，以确定最适合的表达系统。

二、基因工程的构建基因工程构建是细菌发酵生产重组蛋白的关键步骤之一。

该步骤涉及到目标基因的选取、克隆和转化等过程。

1. 目标基因的选取：首先需要选取与目标蛋白相关的基因序列，并进行PCR 扩增。

在选择基因序列时，需要考虑到目标蛋白的活性、稳定性以及易于表达等因素。

2. 克隆：将PCR扩增得到的基因序列与表达载体连接，形成重组的基因。

常用的连接方法包括限制性内切酶切割和连接酶催化反应。

完成连接后，将重组的基因序列转化到宿主细菌中。

3. 转化：将构建好的重组基因导入到适合的宿主细菌中。

可以通过化学转化、电转化或热冲击等方法完成转化。

转化后，需进行筛选和鉴定，选择转化效果最好的细菌株。

三、发酵过程的优化发酵过程的优化是细菌发酵生产重组蛋白的关键步骤之一。

通过优化发酵条件和培养基组分，可以提高蛋白的产量和纯度。

1. 优化发酵条件：包括温度、pH值、培养基组分和气体供应等。

温度和pH值是影响细菌生长和蛋白表达的重要因素，需根据不同的细菌株和重组蛋白的特性进行调节。

培养基组分的优化包括选择合适的碳源、氮源和无机盐等，以提供充足的养分供应。

另外，气体供应也是优化发酵过程的关键，通气和搅拌能够提供充足的氧气和混合培养基，有利于细菌的生长和蛋白表达。

关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。

随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。

根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。

但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。

用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。

一．什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。

2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。

3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。

（1）原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。

因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。

重组蛋白的详细介绍
重组蛋白是一种通过基因工程技术生产的蛋白质。

它是将目标基因通过克隆和表达系统引入宿主细胞中，使其合成并表达出目标蛋白质。

与传统的蛋白质生产方法相比，重组蛋白具有以下优点：
1. 特异性高：重组蛋白可以根据需要设计和改造，具有特定的结构和功能，能够满足特定的研究和应用需求。

2. 纯度高：通过基因工程技术，可以控制表达系统，获得高纯度的重组蛋白，减少杂质的干扰。

3. 大量生产：重组蛋白可以在宿主细胞中高效表达，实现大规模生产，满足工业化应用的需求。

4. 可定制性：可以对重组蛋白进行修饰和改造，如添加标签、改变氨基酸序列等，以满足不同的实验和应用要求。

重组蛋白在生物医学研究、药物开发、诊断试剂等领域具有广泛的应用。

它可以用于研究蛋白质的结构与功能、筛选药物靶点、开发新型药物、制备抗体等。

需要注意的是，重组蛋白的质量和活性取决于多个因素，如表达系统的选择、培养条件的优化、纯化方法的合理性等。

在使用重组蛋白时，需要进行质量控制和活性检测，确保其符合实验和应用的要求。

总之，重组蛋白作为一种重要的生物技术产品，为生物医学研究和相关领域的发展提供了有力的工具和资源。

关于重组人血白蛋白的系统性表述人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。

随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。

根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。

但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。

用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。

一．什么是重组人血白蛋白1.定义通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。

2.rHSA的等级分类按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。

3.rHSA的表达系统分类白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。

（1）原核表达系统HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。

因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。

一、原理
1、E . coli 表达系统
E . coli 是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达
提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

二、步骤
1、一活：从-80℃取菌株，50 mL LB+50 uL抗生素（pet32:AMP，pet28:Kana）+50uL菌种（根据菌活性可多加），置于恒温振荡器中（37℃，150 rpm）培养过夜（约12 小时）。

2、二活：1 L LB+1 mL抗生素+50mL菌种，于恒温振荡器上（37℃，200 rpm）培养2小时。

3、取1.5 mL诱导前菌种，标记，加1 mL IPTG至二活后的LB培养基中根据相应条件诱导表达（低温(125rpm)，高温(150rpm)，8h，12h，20h）
4、诱导后取1.5mL菌，12000rpm离心2min，弃上清，加100uL PBS（可根据情况加50uL），吹打均匀(诱导前保留的菌也同样处理)，煮样，跑电泳。

蛋白表达系统分类-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白表达系统是一种重要的生物技术工具，被广泛应用于抗原制备、药物研发、基因工程、蛋白质学等领域。

它通过利用生物体内特定的遗传信息和代谢途径，将外源基因转化为蛋白质产物。

蛋白表达系统的分类主要根据基因表达介体的类型，可以分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统。

真核细胞表达系统主要利用哺乳动物细胞或昆虫细胞等真核细胞作为基因表达的宿主，能够产生复杂的蛋白质结构和正确的糖基化修饰。

而原核细胞表达系统则采用细菌或酵母等原核细胞作为基因表达的宿主，具有表达速度快、成本低等优势。

不同类型的蛋白表达系统具有各自的特点和适用领域。

真核细胞表达系统适用于需要复杂蛋白质结构和糖基化修饰的研究和应用，比如抗体制备和疫苗研发。

原核细胞表达系统则更多应用于产生大量重组蛋白质的需求，比如重组酶的制备和蛋白质互作研究。

随着生物技术的不断发展，蛋白表达系统也在不断创新和完善。

例如，通过引入特定的转化子和表达载体，蛋白表达系统的产量和纯度得到了显著提高。

同时，基因工程技术的进步也为蛋白表达系统的开发提供了更多的机会和可能性。

未来，随着对蛋白质功能和结构的深入研究，蛋白表达系统将在生物医学研究和药物开发等领域发挥更加重要的作用。

综上所述，蛋白表达系统是一种关键的生物技术工具，通过利用生物体内的遗传信息和代谢途径，转化外源基因为蛋白质产物。

其根据基因表达介体的类型可分为真核细胞表达系统和原核细胞表达系统，各具特点和适用领域。

随着科学技术的进步，蛋白表达系统的发展前景是十分广阔的。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以描述文章的组织和布局，以及每个章节的内容概述。

以下是一个可能的写作示例：在本文中，将对蛋白表达系统进行分类，并深入探讨每个分类的特点、应用领域和发展历程。

本文主要分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分首先对蛋白表达系统进行概述，介绍其在生物医学领域的重要性和应用价值。

利用原核和真核系统在重组蛋白质表达中的比较当今生物科学领域中，蛋白质表达技术的发展一直备受关注。

利用原核和真核系统来重组蛋白质，是常见的两种方法。

这两种系统在蛋白质表达中有着各自的优势和适用范围。

一、原核系统的蛋白质表达原核系统主要指大肠杆菌（Escherichia coli，简称E.coli）等细菌，并且是最常用的蛋白质表达系统之一。

原核细胞具有复制速度快、易于培养、表达量高等特点，使其成为研究人员的首选。

在原核系统中，通常使用表达载体质粒将目标基因插入到细菌细胞中，并利用细菌自身的转录、翻译系统来实现蛋白质的合成。

在表达载体上，一般包含启动子、转录终止子、选择性标记等功能元件，以控制目标基因的表达和纯化。

原核系统的蛋白质表达具有高效、简便、经济等优势。

然而，由于原核细胞的风险素材含量高，存在内源性的蛋白质翻译后修饰机制有限等局限，某些复杂蛋白质的表达可能会受到限制。

二、真核系统的蛋白质表达真核系统主要指哺乳动物细胞（如CHO细胞）、昆虫细胞（如Sf9细胞）等，相对于原核系统，真核系统具有更接近生物体内蛋白质表达的环境，更能实现复杂蛋白质的表达。

在真核系统中，常用的蛋白质表达包括稳定转染和瞬时转染两种方式。

稳定转染是将目标基因整合到宿主细胞的基因组中，从而实现长期稳定的表达。

而瞬时转染则是将目标基因引入宿主细胞的质粒中，通过短时间高表达来获得大量蛋白质。

真核系统的蛋白质表达能够实现更多的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、乙酰化等。

这些修饰对于某些蛋白质功能的发挥至关重要。

此外，真核细胞中包含更多复杂的蛋白翻译机制和分子伴侣蛋白，有利于蛋白正确折叠和纯化。

然而，真核系统的蛋白质表达过程更为复杂，所需时间和成本也相对较高。

此外，真核细胞具有更严格的质控机制和蛋白降解系统，蛋白质的表达稳定性较差。

三、原核与真核系统的比较原核和真核系统的选择应根据具体的研究目的和需求。

如果目标是表达小分子量、水溶性和结构简单的蛋白质，原核系统是较好的选择。

重组蛋白的表达1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）时期，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面阻碍到下游的分离纯化，因此在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的阻碍，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。

目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著阻碍下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依靠于所选择的表达系统。

选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间能够幸免破裂细胞的步骤，同时由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对集合的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的阻碍，关于其中的有些缺点能够通过一定的方法进行克服和幸免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能爱护目标蛋白不被降解（96）。

表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破裂表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的开释周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离爱护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的阻碍，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一样具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。

详述重组蛋白表达系统一、重组蛋白表达系统概述蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。

通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。

一般由以下几个部分组成：1、宿主。

表达蛋白的生物体。

可以为细菌、酵母、动物细胞，植物反应器、动物反应器等。

由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。

2、载体。

载体的种类与宿主相匹配。

根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。

载体中含有外源基因片段。

通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。

3、辅助成分。

有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。

比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。

二、大肠杆菌表达系统在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。

优点：表达水平高，低成本，易培养和大规模工业生产，生产迅速培养周期短，转化操作简单，蛋白表达量高且可以通过多个参数进行优化，容易形成二硫键。

缺点：蛋白折叠性较差（包括细菌蛋白），易形成包涵体，与真核生物不同密码子体系，真核蛋白表达后很少的翻译后修饰，分泌大量内毒素。

三、酿酒酵母不产生毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。

因此，酿酒酵母一般不用做重组蛋白质表达的宿主菌。

优点：表达水平较高，分泌蛋白或细胞表达的良好选择，易培养且培养低成本。

拥有大多数真核生物的翻译后修饰，蛋白表达后有效折叠，无内毒素分泌。

缺点：比毕赤酵母的表达水平低，分泌能力可能低于毕赤酵母，糖基化与哺乳动物细胞不同。

过糖基化，N-端糖基链结构具有致敏性四、甲醇酵母表达系统（毕赤酵母）甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。

重组蛋白诱导表达的原理
重组蛋白诱导表达技术是研究的重要手段，用于发掘目标蛋白质，表达，并验证它的生理作用。

重组蛋白诱导表达技术，也称重组蛋白表达，是基于当前分子生物学过程的一类新兴技术，它利用基因工程原理重新构建出指定的质粒，依据基因组结构，使之不断发挥交互作用，以表达相应的蛋白质，从而实现蛋白质的精准调控。

早期，重组蛋白表达技术主要采用噬菌体来介导表达，但随着质粒的生物学改造技术的阐述及研究，其他类型的质粒，如嗜热菌嗜热表达系统，也被研制出来，以解决细菌抗性问题及噪声表达的假阳性问题。

此外，构造不同序列结构形式的重组蛋白表达载体，利用现代分子生物学技术已成功构建出细菌、酵母菌、哺乳动物疫苗表达系统，具有良好的重组蛋白表达性能，可大幅度提高重组蛋白表达水平，在研究蛋白质相互作用及生物转录中发挥重要作用。

控制蛋白质表达通常靠调控元件的表达水平，其中，启动子和终止子的表达为重要，质粒形式的构造可以有效提升重组蛋白的表达能力，不仅可以控制重组蛋白表达的量级，并且可以控制重组蛋白在特定细胞株或细胞类型中的表达。

研究表明，具有正确的调控起始点或其他模板序列的表达载体，可以增加表达产物的高水平与持久的表达。

综上所述，重组蛋白诱导表达技术是一种多功能的，灵活的技术，可以有效实现精准调控重组蛋白的表达水平。

这种技术的发展，不仅使研究者能够更为精细地解析特定蛋白质的生物功能，而且还有可能促进相关药物开发与应用，以创造更有效的治疗方案。

第23卷　第1期2007年1月福建师范大学学报(自然科学版)Journal of Fujian N o r m al U niversity (N atural Science Editi on )V o l 123　N o 11Jan 12007文章编号:100025277(2007)0120100205基因重组蛋白质的表达系统与分离纯化研究进展刘　华,李　敏3(福建师范大学生命科学学院,福建福州　350108) 摘要:介绍了近年来重组蛋白质的常用表达系统以及各种分离纯化技术等研究和应用的进展情况.关键词:重组蛋白质;纯化;进展中图分类号:Q 936 文献标识码:A　收稿日期:2006205222　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370414;30570956)　作者简介:刘华(1981—　),男,福建政和人,硕士研究生.3通讯作者:m li @fjnu 1edu 1cnProgress on the Expression System andPur if ica tion of Recom b i nan t Prote i n sL IU Hua ,L IM i n 3(Colleg e of L if e S cience ,F uj ian N or m al U niversity ,F uz hou 350108,Ch ina )Abstract :T he study and app licati on w ere introduced on the exp ressi on system in common use and separa 2ti on and purificati on technique of recom binant p ro teins in recent years.Key words :recom binant p ro teins ;purificati on ;p rogress随着基因重组技术的发展,选择表达系统对于目的产物制备是相当重要的,因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白,纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统,对一种重组蛋白质的纯化通常采用多个系统.重组蛋白质在分离纯化的过程中,必须维持一定的浓度和生物活性形式,以及防止被降解.从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一直是个难题.自20世纪70年代分子生物学技术诞生以来,促进生物技术公司加速了重组蛋白质纯化技术的发展,在蛋白质纯化步骤、纯度以及节约成本等方面下大功夫,但纯化过程所需成本仍占总成本的60%～70%,产物的溶解性、纯度、得率和纯化速率之间有牵制关系.蛋白质的分离纯化因其不同的性状、片段大小、所带电荷和疏水性等因素采取相应的步骤,其中蛋白质的疏水性质使纯化过程变得更加复杂.总的来说,纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质,方法有浓缩沉淀、亲和层析、离子交换、反相层析和膜过滤等.1　表达系统111　表达系统的类型重组蛋白质的表达系统主要有原核和真核表达系统,在真核系统中常用酵母和哺乳动物表达系统等.对于单一结构和无修饰的蛋白质,原核系统稳定有效.Jo sh i 等[1]报道重组人类白细胞素13(hum anin terleuk in 213,I L 213)在IPT G 诱导6h 的蛋白质表达量最高.但若将宿主菌BL 21(D E 3)改变为BL 21(D E 3)pL ysS (带溶菌酶质粒),纯化时不用外加溶菌酶.然而,许多真核蛋白的表达过程还需要有翻译后修饰,如单链修剪、糖基化、磷酸化和酰基化等,表达初产物通过细胞基质时发生折叠、二硫键形成以及翻译后转变.大肠杆菌表达可溶性异种蛋白质时存在局限性,折叠时蛋白质有聚集的趋势以及容易被宿主的蛋白质酶降解,聚集的趋势和机制取决于重组蛋白质本身.不同的重组蛋白质在大肠杆菌表达有的以可溶性折叠物回收,有的以包涵体形式生成的蛋白质通过过表达的分子伴侣变得可溶和有活性.已报道过表达的分子伴侣可增加重组激酶的溶解性,这为在大肠杆菌中大量生成和纯化可溶性的蛋白质提供了基础.研究表明,此方法可适用于增强重组蛋白质的溶解性.毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白质的表达载体.它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点.E 1coli 表达重组体易于形成包涵体,限制了有活性产物的产量.毕赤酵母能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工,并能对许多蛋白质产物进行分泌,使产物易于提纯[2].哺乳动物细胞表达重组蛋白质的特点是表达产物不需要再折叠,合成是连续的,可完成翻译后修饰.由CHO (Ch inese ham ster ovary 中国仓鼠卵巢细胞)分泌的蛋白质无需折叠,缺点是表达水平低或产物不稳定.乳腺作为生物反应器之一,用于表达重组蛋白质的优点是产生高浓度的经过翻译后修饰的可溶重组蛋白质.在转基因动物中表达重组蛋白质可解决再折叠问题和降低药品成本,并可保持高浓度,但缺点是需要用数年时间使转基因动物成熟,在奶液中仍然有蛋白质酶可降解重组蛋白质.近年来杆状病毒表达系统成为重要的表达蛋白质的方法.利用双链DNA 病毒感染昆虫作为宿主,因为缺少脂多糖(为毒性物质),可分泌大量蛋白质到培养基中,使得后续的纯化更容易,可应用于抗生素和胞外水解酶的生产.Pechan 等[3]用3种表达系统对于重组玉米半胱氨酸蛋白质酶进行比较,发现杆状病毒表达系统产生正确加工和活性的蛋白质酶,E 1coli 表达系统产生有限的可溶和酶活的产物,而毕赤酵母表达系统虽然生成大量产物,但多数是不溶和无活性的.此外,也可应用变形虫表达在其他系统难以研究的异种蛋白质,特点是易于对蛋白质进行修饰.112　包涵体的处理大肠杆菌通常用于异种蛋白质的表达,然而过表达会产生不溶和无活性的多肽,不溶解的聚集物通常成为包涵体,必须重新增溶、变性和复性以促进分子内正确二硫键和自然构象的形成.再折叠的过程需要用改变物质化学本性的方法来增加蛋白质可溶性,如变性剂或强碱物质胍、氢氯化物、尿素或碱的加入.以重组鱼生长激素变性和复性的优化条件为例,包涵体溶于6m o l L 的盐酸胍,在pH 10的缓冲液透析24h ,变性的重组鱼生长激素至少有20%复性.Patra 等[4]对比了重组人生长因子(recom 2b inan t hum an grow th ho r m one ,r 2hGH )在8m o l L 尿素和6m o l L 盐酸胍中的溶解度,疏水作用和离子交换作用是r 2hGH 包涵体形成的主要原因.r 2hGH 包涵体完全溶解于100mm o l L T ris 缓冲液(pH 1215,2m o l L 尿素).通过D EA E 琼脂糖离子交换层析和排阻层析,r 2hGH 纯化单体的产量占初始包涵体蛋白质的50%.重组人血红蛋白质以包涵体形式存在,8m o l L 尿素溶解后,Q 2Sepharo se FastF low 阴离子交换纯化,经Sephacryl 2100凝胶过滤纯化.结果两步纯化后重组人血红蛋白质的纯度达90%左右,纯化产物复性后,具有与氧结合的能力[5].控制包涵体的形成要认识折叠中间体的稳定性和与它们相互作用的因子.促进活性和稳定的蛋白质构象状态形成的技术包括分子伴侣帮助再折叠、氨基酸替代、去垢剂、聚乙烯乙二醇辅助折叠、颠倒折叠胶粒以及抗体帮助折叠蛋白质,也可通过降低温度来增加产物的可溶性.Yan 等[6]报道了重组寡肽酶B (o ligop ep tidase B ,OpdB )的融合表达(在N 端加组氨酸标记),虽然大部分OpdB 以包涵体形式表达,但是当表达温度从37℃变成30℃时,OpdB 的溶解性显著增加.这也说明合理参数的选择对于蛋白质正确成熟是必要的(如温度、离子强度、辅因子等).一种条件就可能影响或控制折叠中间体的聚集.也可通过改变氨基酸位置抑制聚集,对于低溶解度的蛋白质,有两种方法可考虑:(1)Β片层残基的突变;(2)可溶性基序的增加,在N 端或C 端增加3个赖氨酸基因.2　主要分离纯化方法211　样品准备与预处理样品准备是最单调耗时的步骤,其主要目标是在合适溶剂中析出物的溶解度,尽可能地从溶液中101　第1期 刘　华等:基因重组蛋白质的表达系统与分离纯化研究进展201福建师范大学学报(自然科学版) 2007年　移除杂质以及尽可能地进行病毒灭活.样品准备会由于重组蛋白质的可溶与否而截然不同.从包涵体中回收蛋白质的第一步是细胞裂解.细胞裂解通常应用超声、高压匀浆或研磨,提高能量、流量以及增加时间会促使细胞碎片的减少.为了减少细胞碎片的量,还要进行预处理.例如在高压匀浆之前加热和酶的预处理可使杆菌释放热稳定酶.假丝酵母和酵母的酶预处理改良了细胞破碎效果,低压匀浆减少了时间、能量消耗,减少了细胞碎片.包涵体洗涤和细胞破碎的整合也可减少下游步骤.预处理后使得匀浆既在低压下进行又减少了在下游过程中包涵体洗涤的步骤,因为包涵体在破碎过程中被释放和洗涤.对盐酸胍敏感的可溶的重组蛋白质在高压匀浆下可以从细胞中释放而不需要预处理.许多基因工程药物常受到毒性物质污染,有许多方法可以在不稳定产物中钝化病毒,但缺点是使产物适用性受影响.例如过滤成本高且限制了产量;蒸汽加热耗时且会破坏蛋白质;辐射也会破坏蛋白质;紫外照射对有些病毒是无效的,通常依赖于污染的感光性化学物质的激活,然而产物的光渗入难以达到;洗涤剂对非油脂包被的病毒无效;臭氧系统难于控制,经常造成产物破坏以及化学污染.目前发展的微波病毒灭活带来最小产物破坏,具有无污染、大规模、低成本以及宽光谱病毒灭活的优点. 212　层析技术21211　层析方法的选择大多数蛋白质纯化方案基于多步层析方法的次序排列.这些步骤有时是耗时低效的,因为合理纯化方案的设计要求有完整的系统性.蛋白质和多肽是带有多功能和可变结构的分子,它们的层析行为复杂.基质的选择十分重要,包被小的非孔粒子或极端大孔颗粒的柱子使得纯化效率提高.聚合树脂粒子呈现不同基质的排列和功能性,比硅粒子持久耐用.在亲和层析中,聚合树脂比琼脂糖支持物持久耐用.对复杂蛋白质用单一的层析方法纯化是不够的,这里没有标准条件,只有不断选择试用.离子交换层析(IEC)、反相层析(R PC)或亲和层析是两相分离的温和有效的主要方法.W u等[7]报道了分泌的重组内源血管发生抑制因子(endo statin,EDN)通过SP琼脂糖FF离子交换层析和琼脂糖2肝素H i2 T rap亲和层析纯化,纯度达到98%.W ang等[8]使用CHO2GS系统表达嵌合抗体以及发展了简单有效的纯化方法,第一步用亲和层析,得率和纯度分别为60%和91%,第二步用反相高性能液体色谱法(H PL C)纯化,纯度大于99%.液相层析技术中,目前主要在改进纯化操作系统的性能和提高载体介质的性能上.此外,扩张柱床吸附、径向膜层析、灌柱层析、液液萃取、置换层析、金属鳌和亲和层析等技术均在发展中.对于下游纯化过程,还可用陶瓷羟磷灰石(CH T),它是一种钙磷酸盐支持物,可替代离子交换(IEX)和疏水相互作用(H I C).羟磷灰石是第一种用于蛋白质分离的材料之一,现在羟磷灰石变成机械坚硬、化学稳定的陶瓷形式.Stok等[9]在芽孢杆菌中表达B io ,纯化策略为离子交换、凝胶过滤、羟磷灰石层析三步法获得B io .W ada等[10]利用杆状病毒表达系统表达重组环前列腺素合酶(p ro sta2 cyclin syn thase,PG IS),其以微粒体形式表达,通过磷酸钙凝胶吸收,再经过D EA E2琼脂糖和羟磷灰石柱层析纯化获得PG IS.戴文氏杆菌致死因子(B acillu s an th racis lethal facto r,L F)融合蛋白质的纯化通过3种层析步骤(苯基琼脂糖、Q2琼脂糖、羟磷灰石),纯度达到95%以上[11].21212　亲和层析亲和层析技术对于重组蛋白质的分离纯化应该是最有效的方法.如果将一些亲和性标签构建到重组融合蛋白中,能便于用亲和层析来纯化重组蛋白.传统亲和层析过程用单克隆抗体(或多克隆抗体)作为亲和配基.但单克隆抗体通常由动物细胞在复杂介质中生成或在噬菌体上表达,用于亲和配基前必须纯化.W agner等[12]使用哺乳动物表达系统(CHO细胞),用马的IgG1重链恒定区作为表达马的细胞因子(IFN2gamm a,I L22,I L4,T GF2 beta1)的检测和纯化的标签.在亲和性标签中,金属和染料亲和配基相比于抗体配基有较低的特异性.金属离子如锌、铜在蛋白质中与组氨酸残基结合.具有不同组氨酸残基数的蛋白质可被金属亲和过程分离.为了增加特异性,可在蛋白质C端增加多个组氨酸.蛋白质纯化后,组氨酸尾巴可被切除.Fang等[13]构建重组6xH is2V ac基因于E 1coli 表达,表达的H is 融合蛋白质大多以包涵体形式存在.包涵体通过8m o l L 尿素溶解,N i 2N TA 柱层析以及尿素梯度透析,得到高产的重组V ac 蛋白质.Chatterjee 等[14]报道了构建在N 端或C 端结合六组氨酸或Strep tag 标记的表达载体表达L 222羟基酮脱氢酶,通过辅因子或重组烟草蚀刻病毒蛋白质酶(rT EV )去除标记,纯化时用固定的金属亲和层析或strep tactin 亲和层析一步即可.通过rT EV 去除组氨酸标记,L 222羟基酮脱氢酶获得完全活性.染色配基可与亲和基质通过共价键紧密结合.它们或许是有毒性的,然而与蛋白质的相互作用是非特异的.很容易将一种染色配基结合到特定目的蛋白质上,但是回收产物的纯度并不高.肽链是比抗体更稳定的配基,更具有特异性.相比于染料,肽链是非毒性的.肽链和蛋白质相互作用是温和的,产生温和的洗脱分离条件.肽链数据库可由噬菌体生成或化学合成.在噬菌体肽链数据库中,给定长度的任意基因片断被合成然后插入到噬菌体基因中.一旦肽链顺序被确定,可化学合成并固定在支持物上.融合蛋白质通常有容易纯化的特性.用于蛋白质纯化的标记有聚组氨酸(以镍离子作为配基)、FLA G 肽、抗生物素蛋白质链菌素、聚天冬氨酸(阴离子树脂)、聚精氨酸(阳离子树脂)以及聚苯丙氨酸等.而参于亲和纯化的蛋白质融合伙伴有:蛋白质A 、谷胱甘肽S 2转移酶、麦芽糖结合蛋白质、半乳糖结合蛋白质、Β2半乳糖激酶、氯霉素乙酰转移酶、乳糖抑制物等.重组人胰高血糖素样肽21(rhGL P 21)高密度发酵培养的菌体超声破碎后,裂解液用Glu tath i one 2Sep haro se 4B 亲和层析纯化得到GST 融合蛋白质,经CNB r 裂解、QA E 2Sepharo se 柱层析和脱盐,得到纯度大于90%的rhGL P 21,质谱测定相对分子质量结果与理论值一致.生物学活性分析表明,rhGL P 21具有明显的降血糖活性[15].L u 等[16]用p GEX 26p 23载体在E 1coli 表达两种大米抗坏血酸过氧化酶A PX 基因(A PXa 和A PXb ),A PX 以GST 融合蛋白质表达,通过谷胱甘肽琼脂糖4B 柱亲和层析,最终产量分别为40、73m g .源于环状芽胞杆菌W L 212的壳聚糖酶A 1的壳聚糖结合区(Ch itin 2b inding dom ain ,ChBD )由45个氨基酸组成,显示出显著的壳聚糖特异性,ChBD 融合于乙内酰脲酶基因编码区C 端,在E 1coli 中表达,表达产物中8%为可溶性蛋白质.融合ChBD 的乙内酰脲酶直接吸附在壳聚糖上,SD S 2PA GE 分析显示,融合蛋白质和亲和介质的联接有高度特异性、稳定性和可逆性[17].213　其他方法采用冻融循环可以从大肠杆菌胞质中有效分离重组蛋白质,沉淀方法可降低下游纯化成本.虽然不是很有效,沉淀作为初始纯化步骤可减少后续步骤数.杂质通过沉淀去除,目的蛋白质留在上清液中.蛋白质沉淀方法有改变pH 、温度,使用卤化物、盐、有机溶剂(例如乙醇)、金属离子(例如铜)、聚电解质(例如聚乙烯亚胺)、亲和配体以及染料、热敏可溶多聚物等.高盐沉淀是瞬间的、无定形的沉淀,包含多种不同蛋白质,而结晶法可得到纯度高的结晶蛋白质.Honda 等[18]纯化重组人生长分化因子25(recom b inan t hum an grow th differen tiati on facto r 5,rhGD F 5)(以包涵体形式表达)时,利用“直接再折叠”方法,通过过滤、等电沉淀、反相层析后,最终纯化产量为20%,纯度达到99%.与传统3步层析法比较,纯度相同的情况下产量增加2倍.此外,膜蛋白质的纯化比可溶蛋白质困难的多,可用连续洗脱电泳法获得更高的产量.常规层析对于大规模蛋白质纯化是有局限性的,而膜吸附则具有快速、规模化的特点.Castilho 等[19]利用CHO 细胞系生产重组人类抗H I V 免疫球蛋白质,用包含蛋白质A 亲和配基的膜吸附器实现细胞分离和产物纯化,免疫球蛋白质被吸附在亲和膜上,然后洗脱下来.Knudsen 等[20]尝试用阴离子交换膜吸附替代传统的离子交换柱去除杂质如DNA 、宿主细胞蛋白质和病毒实现重组单克隆抗体的纯化,以求规模化生产.3　展望基因技术的发展给人们更多关于控制蛋白质合成、折叠和分泌的信息,重组蛋白质分离纯化的发展趋势之一是设计新的宿主细胞优化蛋白质生产和纯化.未来将设计整合生物过程以降低成本,这些策略包括自动蛋白质表达系统、新的介质和柱技术、在线监测系统等.今后重组蛋白质的分离纯化的技术发展将围绕着快速,高分辨率,易于操作,低成本和电脑控制的全自动化等技术而展开.301　第1期 刘　华等:基因重组蛋白质的表达系统与分离纯化研究进展401福建师范大学学报(自然科学版) 2007年　参考文献:[1]Jo sh i B H,Puri R K.Op ti m izati on of exp ressi on 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