猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株的分离鉴定

*基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)项目（No.G1999011901）。

高志强：1974年生，男，博士研究生。

**通迅作者。

Author for correspondence,E-mail:<yhanchun@>.收稿日期：2003-04-17接受日期：2003-05-12农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):283~287·研究论文·猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因的变异分析*高志强郭鑫查振林陈艳红杨汉春**（中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室，北京100094）摘要：从河北、江西猪场中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒（HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002和JX-1/2002）。

采用RT-PCR 方法扩增其完整的基因片段，进行了序列测定，并与其它5个国内毒株的基因序列进行了比较和变异分析。

所有这些毒株的基因均编码200个氨基酸，推导的氨基酸相似性在88.2%~99.0%之间。

其中BJ-4、S1及J1间的相似性较高，在98%~99%之间；HB-1(sh)/2002，HB-2(sh)/2002，JX-1/2002及CH-1a 间的相似性为92%~96%之间。

根据基因核苷酸序列的遗传进化距离，这些毒株可分为两个亚群，BJ-4、S1和J1为一个亚群，与VR2332及疫苗毒株接近；HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002、JX-1/2002和CH-1a 为另一个亚群。

关键词:猪繁殖和呼吸综合征病毒；基因；变异分析Variation Analysis of the Gene of Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus （PRRSV ）GAO Zhi-Qiang GUO XinCHA Zhen-Lin CHEN Yan-Hong YANG Han-Chun**(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine ，Ministry of Agriculture ，China Agricultural University,Beijing 100094,China)Three porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRSV)isolates (HB-1(sh)/2002，HB-2(sh)/2002and JX-1/2002)were obtained from Hebei and Jiangxi Provinces'pig farms.A RT-PCR method was used to amplify the complete gene of the viruses.Variation analysis ofgene of the three isolates and other five published PRRSV isolates in China showed that all ofthese isolates belonged to American type,and percent identity of amino acid ranged from 88.2%to 99.0%.gene among BJ-4,S1and J1had higher similarity,sharing 98%~99%identity of the deduced amino acid.HB-1(sh)/2002,HB-2(sh)/2002,JX-1/2002and CH-1a showed 92%~96%identity among theirgene.Phylogenetic analysis suggested that these isolates could be dividedinto two subgroups according to the genetic distance.BJ-4,S1and J1belonged to one subgroup,which are more close to VR2332and vaccine strains,whereas HB-1(sh)/2002,HB-2(sh)/2002,JX-1/2002and CH-1a belonged to anothersubgroup.porcine reproductive and respiratory syndrome virus;gene;variation analysis猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus ，PRRSV)为动脉炎病毒科成员之一,可引起妊娠母猪流产、早产、产死胎、弱胎、木乃伊胎、仔猪和肥育猪的呼吸道症状。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）PRRS，又称猪繁殖与呼吸综合征，猪蓝耳病，猪流行性流产----呼吸综合征，是近年来发现的一种病毒性传染病，给养猪业造成很大的经济损失。

本病主要引起母猪繁殖障碍，仔猪肺炎和断奶前后仔猪的死亡率增高，自1987年在美国，1990年在欧洲被发现后传播蔓延速度十分惊人，病毒分离和血清检查表明，PRRS现已传遍世界主要养猪国家。

1995年，我国在北京郊区首次暴发了PRRS，1996年以来，国内一些单位进行的流行病学和血清学调查证明，我国大部分省市都已有此病，且血清阳性率都很高，但呈地方性流行特征。

特别是2002年大有全国一片蓝的趋势。

针对PRRS的现状，各国都已引起高度重视，近年来在流行病学，免疫学及致病机理，实验室诊断技术，综合防制等方面开展了大量的调查研究工作，PRRS的诊断与防制尤其成为当前兽医研究的一个热点。

（--）病原PRRSV为一有囊膜的病毒，直径50---65nm,表面相对平滑，立方形核衣壳，核心直径25—35nm。

PRRSV对热敏感，这种敏感性提示用于病毒分离的血清和组织样品应保存在-20C下或4C条件下，以保护样品的感染性，用脂溶剂氯仿和乙醚处理以后，PRRSV失去活性。

北美和欧洲PRRSV分离株虽然不能凝集进行实验的各种红细胞，但最近的研究发现，部分毒株及用去污剂预处理的毒株可以表现出对一定动物红细胞的凝集性。

PRRSV具有严格的宿主特异性，最初是用猪肺泡巨噬细胞（PAM）及其它组织的巨噬细胞进行病毒的分离与鉴定的，在体外培养中，PRRSV可以在猪肺泡巨噬细胞（PAM）和非洲绿猴肾细胞（vero）及其衍生的细胞系如MARC—145，CL——2621中生长。

在肺泡巨噬细胞的培养物种加入PRRSV抗体后，可使病毒的复制增强，同样在病毒中加入PRRSV抗体后，其在妊娠期胎儿体内的复制也大为增强，这种现象称为抗体依赖性增强作用（ADE）其原因可能是病毒与抗体形成免疫复合物后借助细胞表面Fc受体与PAM结合，从而促进了病毒进入细胞。

猪繁殖与呼吸综合征病毒在新鲜猪肉中存活情况的研究Guarino H;吴艳【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(41)3【摘要】猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,仍是严重影响经济的最重要猪病之一。

研究结果发现PRRSV通过多种方式传播,其中气溶胶是最主要的传播形式。

通过污染的猪肉传播可能是一个潜在危险,但尚未被研究。

试验通过3种不同浓度的PRRSV人为污染新鲜猪肉,旨在研究室温(25℃)、冷藏(4℃)和冷冻(-20℃)3种温度下病毒的存活情况。

本试验研究了代表其自然感染水平和最严重情况的病毒浓度。

结果显示,室温条件下,接种后48h均可检测到3种不同浓度的病毒;4℃条件下,较高浓度接种的猪肉中病毒可存活6d,较低浓度接种的猪肉中病毒可存活3d;冷冻条件下,较高浓度接种的猪肉中病毒可存活60d,较低浓度接种的猪肉中病毒可存活7d。

本试验结果表明,新鲜猪肉可能成为PRRSV传播的工具,但依赖于其储存的温度和时间。

【总页数】1页(P23-23)【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒;存活;温度;时;间;储存【作者】Guarino H;吴艳【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.国家自然科学基金资助猪繁殖与呼吸综合征病毒研究情况分析 [J], 杜以军;任红艳;胡景杰2.猪繁殖与呼吸综合征疫情与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型的相关性研究 [J], 马晶晶;高俊锋;吴碧清;韩相敏;李桃梅;赖志3.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染猪组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的分布 [J], 李燕华;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林4.运用反转录聚合酶链反应检测猪肉中猪繁殖和呼吸综合征病毒 [J], 王树成;郭秀艳5.猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肉制品中存在情况的研究 [J], Guarino H;吴艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定吴香菊;李芳韬;陈蕾;丛晓燕;孙文博;于江;陈智;郭立辉;吴家强【摘要】试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础.根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况.IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍.且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异.证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)008【总页数】7页(P2074-2080)【关键词】Marc-145;CD163;稳定细胞系【作者】吴香菊;李芳韬;陈蕾;丛晓燕;孙文博;于江;陈智;郭立辉;吴家强【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,泰安271000;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东农业大学动物科技学院,山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室,泰安271000;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100;山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室,济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,济南250100【正文语种】中文【中图分类】Q813猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染[1-2]。

猪繁殖与呼吸综合征类NADC30与HP-PRRSV毒株RT-PCR鉴别方法的建立与应用作者：徐雷赵军杨晓宇殷鑫欢张继宗朱玲来源：《江苏农业学报》2019年第01期摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRsv）是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播，导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒，其特性为变异快，存在毒株间的重组。

因此，病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。

本试验建立了一种能够区分类高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADc30与HP-PRRsv毒株的检测方法，根据nsp2基因的高变区的比对结果，选择其保守序列，设计一对检测引物，类NADc30扩增片段大小为334 bp，HP-PRRsv毒株扩增片段大小为514bp，通过优化反应条件，最终建立了一种一对引物就可以区分检测类NADc30与HP-PRRsv毒株的RT-PcR检测方法。

应用本试验所建立的RT-PcR方法对2017年12月至2018年2月采至四川多地区的疑似PRRsv感染发病的46份肺脏进行检测。

结果显示，类NADc30检出率为32.6%，高于HP-PRRsv毒株的检出率（10.9%）。

该方法的建立，为类NADc30和HP-PRRsv毒株的快速鉴别诊断提供了方法，具有重要意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征;类NADc30;HP-PRRsv;鉴别诊断;RT-PcR中图分类号：s828 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0109-05猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）属于动脉炎病毒科，有囊膜，是单股正链RNA病毒，基因组约长13～15kb。

自1987年被首次报道时就一直是影响养猪业健康发展的呼吸道疾病和繁殖障碍的传染性疾病，1996年郭宝清等首次从流产胎儿中分离出PRRSV，证实中国成为了PRRSV流行区域，随后暴发猪繁殖与呼吸综合征，然后发展成为高致病猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine repro-ductive and respiratory svn&ome.HP-PRRS）.并且逐步向全国蔓延。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种猪繁殖和呼吸障碍的传染性疾病。

母猪表现为流产、早产、死产、木乃伊胎及弱仔等。

仔猪和育肥猪则表现为呼吸困难。

仔猪发病率和死亡率很高，对养猪业构成了重大危害。

1临床症状妊娠后期母猪突然出现发热（可高达40℃以上），精神沉郁，嗜睡，食欲减退，呼吸困难，有些母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎和弱仔。

仔猪临床症状明显，早产的仔猪当天或几天内死亡。

初生仔猪发热，喜扎堆，拉稀，多呼吸困难，呈腹式呼吸。

断奶仔猪主要表现呼吸困难、咳嗽、厌食，耳部及腹下皮肤发红，严重的耳尖发绀，病猪消瘦、贫血，最后死亡。

耐过的仔猪表现生长停滞，成为僵猪。

发病仔猪死亡率较高，达80%以上。

2病理变化剖检典型死亡病猪，主要表现为血液稀薄呈水样，淋巴结出血，肺脏水肿、充血、出血，有坏死灶，主要表现为间质性肺炎;肾肿大，有小出血点;肝脏肿大呈黄褐色;肠粘膜出血，肠系膜淋巴结水肿;部分在喉头、心外膜、膀胱粘膜有点状出血。

流产胎儿及弱仔剖检，可见头部、皮下水肿，胸腔内积有大量清亮液体。

根据上述症状和剖检变化初步诊断为猪繁殖与呼吸综合征。

为了进一步确诊，又进行了下列实验室检查。

3实验室诊断 3.1分子生物学诊断我们采用RT～PCR 的诊断方法：取PRRS病料（肺、淋巴结）组织研磨：应用TRIZOL细胞裂解液，按常规方法提取RNA;用下游引物进行反转录;用反转录产物cDNA进行PCR扩增（上游引物5′GCGGATCCATGCGATCTAACAAC3′;下游引物5′AGCGCGAGTCAGGCTAGGGAGGA3′），PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃再延伸10min。

反应结束后，取PCR产物5μL在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。

结果扩增出大小为417bp左右的目的片段，与预期扩增417bp大小的片段相符。

猪繁殖与呼吸综合征实验室检测方法研究进展作者：于自民鲍玉芳何召庆来源：《兽医导刊》 2015年第6期于自民鲍玉芳何召庆/ 中国动物保健品有限公司猪繁殖与呼吸综合征俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，主要侵害不同日龄、品种猪的呼吸和生殖系统，在发病过程中表现为仔猪断奶前高死亡率、育成猪呼吸困难、母猪繁殖障碍为特征的高度接触性病毒传染病，近年来已成为严重危害全球养殖业最严重的疾病之一。

PRRSV感染引起的病毒血症、持续感染等，对我国养猪业疫病防控构成威胁并造成惨重的经济损失，目前是影响我国养猪业最重要疫病之一。

本文拟对该病的实验室检测方法进行归纳总结，以利于快速准确地诊断该病。

一、PRRS 概述PRRS 是猪“高热综合征”的主要疫病之一，属于免疫抑制性疾病，常常引起继发感染，造成免疫失败等。

因此国际兽疫局将其列为B 类传染病，我国将其列为二类传染病。

20 世纪80 年代末美国南部首次报道了PRRSV，随后在德国、加拿大、荷兰一些国家广泛传播。

由于起初不清楚何种病原体引起，根据临床上断奶仔猪呼吸困难、严重肺炎、生产性能下降、母猪严重的繁殖障碍等，称之为“猪流行性和呼吸道综合征”、“猪蓝耳病”、“猪神秘病”等。

1991 年荷兰学者Wensvoort 等用猪肺泡巨噬细胞（PAM）首次分离病毒（LV 株），1992 年美国学者分离到VR-2332 株病毒。

1995 年我国北京地区暴发PRRS，随后类似PRRS 疾病蔓延到华东、华北等地区，1996 年经哈尔滨兽医研究所鉴定为PRRSV 感染。

2006 年夏以来我国又暴发了以变异美洲型病毒（JX-A1 为代表的Nsp2 缺失）为病原的高致病性蓝耳病，据初步统计，猪感染PRRSV 的发病率达50% 以上，死亡率20% ～ 100%。

分子流行病学调查数据显示，2006-2008 年高致病性PRRSV 毒株占国内流行株的78%，2009 年占86%，2010-2011 年占88.9%，加重了许多地区养猪业的经济负担。

猪繁殖与呼吸综合征病毒检测1 范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判定。

本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。

GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫。

NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1193 基因检验实验室技术要求3 缩略语PRRSV: porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP：loop-mediated isothermal amplification, 环介导的恒温扩增RT-LAMP：Reverse transcription, loop-mediated isothermal amplification，反转录环介导的恒温扩增。

4 原理猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)。

该病毒有美洲型和欧洲型两个血清型。

美洲型又有多个基因亚型。

我国流行的美洲型PRRSV主要有传统型、高致病性和类NADC30型毒株，其主要区别存在于病毒的Nsp2基因。

环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体外恒温核酸扩增技术，用于快速检测DNA。

RT-LAMP是一种逆转录LAMP，用于检测RNA。

本标准RT-LAMP，根据PRRSV开放阅读框架7（ORF7）基因序列、ORF1a（非结构蛋白Nsp2）基因序列设计4组引物，建立4种RT-LAMP检测方法（即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4)，其中LAMP1的特异性引物识别ORF7基因，LAMP2、LAMP3和LAMP4的特异性引物识别Nsp2基因。

猪繁殖与呼吸道综合症（PRRS）综合防治技术作者：董江华齐文华朱才亚虞颉来源：《农家致富顾问·下半月》2015年第05期摘要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是近年来发现的一种急性、高度传染性的病毒性传染病。

因为其典型症状为猪耳根到耳尖部成蓝色，故又称之为蓝耳病。

猪蓝耳病已发现30余年，最早于1987年在美国的北卡罗来纳州首次爆发。

最初人们不能确定其病因，故此一度被称为“神秘病”。

1991年荷兰分离到该病的病原“LV”病毒株，欧盟提议将此病命名为“猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）”，1992年国际兽医组织将其定为B类传染病。

PRRS病毒分为欧洲型和美洲型两种，分别以1991荷兰分离的LV和1992年美国分离的VR-2332为代表毒株。

关键词：猪；繁殖；呼吸综合征；防治猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒为单股正链RNA病毒，属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。

不凝集哺乳动物或禽类红细胞，有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。

病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，好在中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强。

鉴于PRRS病毒的生物学特性和流行病学特征，目前要在一个PRRS流行的国家和地区消灭该病几乎无法完成，从长远观点看，这也将是一项非常艰巨的任务。

目前对于一些未使用过PRRS病毒疫苗的小型猪场，可以采用免疫学方法检测抗原或抗体，进行早期诊断，淘汰阳性猪；并且，用PRRS病毒阴性的公猪进行配种或用无PRRS病毒污染的精液进行人工授精。

1 材料与方法1.1 试验时间与地点试验时间为2011年11月12日到2012年5月10日，地点在安徽省宿松县中兴牧业有限公司养猪场，场内共有母猪505头，公猪12头、其中5头为后备公猪，采用人工授精技术，年出栏育肥猪约1万头以上。

1.2 试验材料PRRS疫苗为中牧实业股份有限公司成都药械厂生产的蓝耳病灭活疫苗；保健药物为中草药黄芪多糖（单方）针剂，由北京大北农公司生产；维生素E粉剂由上海三维制药有限公司生产。

猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（CH-1R株）1、高度安全性疫苗弱毒株，毒力不返强，安全，稳定可用于普免安全性试验：从2个方面检测该疫苗所用的PRRSCH-1R毒株的安全性：第一：毒力返强试验：选择对兰耳病毒最敏感的85-93胎龄的重胎母猪做试验，经猪继代3~4次后就很难在血清、鼻拭子检测到病毒核酸，试验母猪没有发生繁殖障碍等临床表现，说明PRRSCH-1R毒株的遗传性状是稳定的。

第二：对疫苗不同免疫剂量的安全性进行了检测，分别以单剂量重复免疫、10倍量大剂量免疫，对怀孕母猪和断奶仔猪的免疫结果观察，各批次疫苗免疫仔猪的临床症状和母猪的产仔情况均正常。

证明该疫苗对猪是安全。

2、超强免疫效力疫苗毒株为国内分离的美洲株。

与2006年“无名高热综合征”中兰耳病分离株同源性达98%以上。

更快启动保护，产生有效保护力。

免疫1周产生抗体，2周产生保护力，可用于紧急免疫。

疫苗效价高于105.0TCID50/头份。

免疫期可达4个月。

免疫保护试验：免疫后血清抗体的检测：免疫28~35日龄仔猪，免疫后7天将能检测到PRRSV 的IFA抗体，免疫后2周，80%以上的猪就可以获得保护。

最小免疫剂量和使用剂量：疫苗滴度达到104.0TCID50/头份的免疫剂量，即可完全保护仔猪和母猪抵抗强毒的攻击，为了确保疫苗的使用效果，我们将疫苗的使用剂量定为105.0TCID50/头份，而实际上我们的出厂标准定为106.0TCID50/头份，相当于100倍的最小免疫剂量。

免疫持续期：通过分别用3个以上批次的疫苗，分别免疫28~35日龄的仔猪和怀孕母猪1次，免疫后5个月，强毒攻毒，保护率为100%。

出于安全的考虑，我们将免疫保护期定为4个月。

3、低免疫应激性免疫健康猪群无体温升高、采食下降和影响增重现象。

猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(Ch-1a株)安全性好由于繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的本身性质决定了该苗具有良好的安全性，该苗选用国内分离毒株（CH-1a株）,该毒株是经Marc-145细胞系传代、多次克隆纯化，筛选出嗜Marc-145细胞生长的PRRSV毒株，该毒株的细胞培养液经化学试剂灭活后，配以医用油佐剂，制成了繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及DNA疫苗的初步研究猪繁殖与呼吸综合症(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染引起的以怀孕母猪繁殖障碍及各年龄段猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病。

2006年,我国爆发了高致病性PRRS,给我国养猪业造成巨大的经济损失。

PRRSV具有高度变异性,研究发现：高致病性PRRSV和传统PRRSV毒株存在很大差异。

其中高致病性PRRSV在Nsp2上普遍存在不连续的30个氨基酸的缺失,ORF5也是变异最大的基因之一,ORF7是较为保守的基因。

本研究设计了三对PRRSV特异性引物,分别扩增4株PRRSV毒株的ORF5, ORF7和Nsp2基因,并克隆至pMD-18T载体上,测序得到基因序列。

利用分子生物学软件对测得的序列及一些国内外分离株序列进行比较,分析病毒分子遗传变异规律。

序列分析表明：4个分离株ORF5基因核苷酸序列同源性为89.4%～99.5%;ORF7基因的核苷酸序列同源性为94.1%-100%；Nsp2基因核苷酸序列同源性83.3%～99.7%。

遗传进化树分析表明：HB毒株与国内疫苗株CH-1a高度同源；DL-US毒株与美洲型代表毒株VR-2332高度同源；JX毒株Nsp2缺失30个氨基酸,与国内报道的高致病性PRRSV毒株JXA1毒株高度同源,与传统毒株VR-2332差异较大。

DL-TB毒株Nsp2基因与传统毒株CH-1a同源性最高,但ORF5以及ORF7基因却与高致病毒株具有很高的同源性,由此推测DL-TB毒株可能是高致病性PRRSV 毒株和传统毒株发生重组后的变异株。

PRRSV分子流行病学研究表明：与传统毒株相比,高致病性的PRRSV毒株,在基因水平上发生了较大的变异,在临床症状上具有更高的致病性和死亡率,能够产生更大的危害。

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第11期2020年11月V ol.42No.11Nov.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.201911018类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒FJZ03株感染性克隆的构建及鉴定勾明郗1,2，林志锋3，邓小莺1,2，黄晓紫1,2，毛婉1,2，徐叶3，李娜1,2，杨小燕1,2，魏春华1,2*，刘建奎1,2*（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364000；2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建龙岩364000；3.福建农林大学动物科技学院，福建福州350002）摘要：为构建类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）FJZ03株的感染性克隆，本研究将该株病毒全基因组分成6段，通过同义突变将其中的A 14378G ，引入了Mlu I 酶切位点为分子标记。

经RT-PCR 分别扩增后，克隆至改造后的载体pSK 中构建中间质粒。

经测序鉴定各质粒正确后，分段连接至pSK 中构建全长cDNA 克隆质粒pSK-FJZ03。

将鉴定正确的pSK-FJZ03转染Marc-145细胞并传代，收集出现CPE 后的病毒液，经RT-PCR 扩增后的产物经Mlu I 酶切和测序鉴定；同时采用激光共聚焦试验鉴定，获得的拯救病毒命名为RvFJZ03。

分别测定RvFJZ03在Marc-145细胞与潴肺泡巨噬细胞（PAMs ）中的生长曲线，比较拯救病毒与亲本病毒的生长特性。

将获得的拯救病毒RvFJZ03在Marc-145细胞中连续传代，对不同代次的重组病毒分别测定病毒效价，并经RT-PCR 扩增后通过Mlu I 酶切和测序鉴定。

测序鉴定结果表明，正确构建了感染性克隆质粒pSK-FJZ03；将其转染Marc-145细胞后并传至第3代出现典型CPE ，经激光共聚焦试验、RT-PCR 及测序鉴定表明拯救了重组病毒RvFJZ03。