流式细胞术临床检测项目操作流程

流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。

在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。

而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。

CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。

CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。

六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。

待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。

七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。

八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。

2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。

3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。

九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。

2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。

以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。

用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。

离心，弃上清。

4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

一、流式细胞术常规项目操作流程二、样本采集和处理些？荧光染色的两种方法意义和注意事项是什么？三、免疫荧光染色3．单克隆抗体的质量控制IVD抗体和ASR试剂，是临床常规项目的首选抗体，性能参数符合临床常规检测要求，已经对两种抗体的特异性、灵敏度、精密度、适用范围进行了验证。

对于商品化质控物可以帮助监测部分单抗的检测效率，如淋系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数、细胞绝对荧光强度、阳性表达、可以作为CD55和CD59抗体的阳性对照和室内质控物。

对于自做阳性或阴性质控物，监测单克隆抗体的质量。

因为有些抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，如健康人红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59，在正常人中是阳性表达，可作为阳性对照和室内质控物。

（二）荧光染色方法1．细胞膜免疫荧光染色大多数免疫表型分析是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。

正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液的目的，保证细胞膜表面抗原活性不被破坏；防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰。

注意事项：红细胞裂解或分离后至少洗涤1次；减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰；进行绝对计数抗原表达量时，不能洗涤红细胞裂解液，因不能改变初始细胞浓度。

2．细胞内免疫荧光染色细胞内免疫荧光染色是采用荧光素或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法。

他的意义在于诊断疾病和判断预后；细胞内髓性过氧化物酶（MPO）、CD3和CD79a的表达帮助白血病免疫分型。

细胞内染色的关键之处，是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性；细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记；确保固定和透膜的步骤不影响抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合。

细胞内免疫荧光染色的破膜剂有皂角素和70％冷乙醇，皂角素最常用最稳定。

70％冷乙醇用于PI与细胞内DNA结合分析细胞倍体和周期时相。

需要注意的是，细胞内染色与细胞活性检测不能同时进行；当荧光染料分子的颗粒足够小时，细胞内染色不需要破膜也可以进行，活细胞染料DAPI、TO和AO等对细胞内核酸染色。

流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。

以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。

一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。

2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。

3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。

4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。

二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。

2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。

3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。

4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。

三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。

2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。

3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。

4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。

5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。

四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。

2. 将样本离心并去除上清液。

3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。

4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。

五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。

2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。

3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。

4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。

5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。

六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。

2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。

临床检验中心流式细胞仪实验室标准操作程序概要简介本标准操作程序适用于临床检验中心流式细胞仪实验室，主要目的是规范操作流程，确保实验结果准确可靠。

实验前准备- 实验人员应先进行必要的文献调研并了解免疫荧光染色的原理和基本方法。

- 接受过正规培训的人员方可进行实验操作。

- 实验前，必须对仪器进行全面检查，确保仪器正常工作。

实验步骤1. 细胞样本制备- 取样前应先向患者或其家属进行必要的告知，并取得其同意。

- 根据实验设计和要求，采集适当数量、质量的细胞样本，并根据实验要求进行必要的处理。

- 对细胞样本进行细胞计数、质量检测等操作。

2. 细胞染色- 根据实验要求，选取适当的细胞染色试剂。

- 按照试剂说明书和操作要求进行操作。

3. 流式细胞仪实验操作- 操作人员应事先熟悉细胞仪的基本原理和操作步骤。

- 检测前，确定细胞浓度和待测指标。

- 按照细胞仪的设置要求进行操作，包括仪器开机、样本放置、参数设置、数据采集等。

- 操作完成后，关机并对细胞仪进行必要的维护和清洁操作。

数据分析和结果处理- 根据实验设计，选择适当的统计学方法进行数据分析。

- 结合实验结果和文献调研，得出结论。

- 保存实验结果和数据记录，并按要求撰写实验报告。

实验安全注意事项- 操作过程中必须戴手套、口罩等防护用品。

- 细胞样本和染色试剂应正确处理和存储，避免产生污染和交叉感染。

- 遵守实验室安全规定，保证操作安全。

结论本标准操作程序是临床检验中心流式细胞仪实验室实验操作的指导，规范操作流程和操作安全，是实验室科研工作中的重要保障。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

所需的实验试剂
1. PBS
2. 1640细胞培养液
3. Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
4. 胰蛋白酶
实验对象：A549细胞
干预措施：含有0、2236、5000ug/ml茶氨酸的细胞培养液
分组：五个组别，即对照组，2236ug/ml茶氨酸培养24h组，2236ug/ml茶氨酸培养48h组，5000ug/ml茶氨酸培养24h组，5000ug/ml茶氨酸培养48h组。

流式细胞仪检测A549细胞凋亡
流式实验步骤
1, 收集对数生长期A549细胞，计数，以(1～5)×105个/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁；次日更换培养液，各孔分别加入含有不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次；
2, 在药物处理24h,48 h后，以不含EDTA的胰酶消化并收集细胞于流式管1000 r/min离心5 min，弃上清。

冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清；
3, 按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明，向细胞中加入Binding buffer 150 μL/管和Annexin-V 5 μL/管，振荡混匀。

室温、避光反应15 min；
4, 再次加入Binding buffer 100 μL/管和PI染料5 μL/管，振荡混匀；
用流式细胞仪检测细胞凋亡。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

《流式细胞术操作规程》一、操作准备1.准备所需材料和试剂：包括流式细胞仪、标记抗体、细胞悬液、PBS缓冲液、显微镜玻片、培养基等。

2.检查仪器：确保流式细胞仪各项功能正常，包括激光、光电倍增管等。

3.样本处理：根据实验需要，选择适当的细胞处理方法，如细胞孵育、酶解消化等，确保获取到高质量的细胞悬液。

二、细胞标记1.标记抗体的选择：根据实验需求，选择适当的标记抗体，包括单抗、荧光染料、生物素等。

2.细胞标记试剂的制备：根据实验方案，将标记抗体按照要求的浓度进行稀释，制备成相应的标记试剂。

3.细胞标记操作：将所需细胞悬液分散在适量的PBS缓冲液中，加入标记试剂，轻轻摇晃混合，静置于室温下孵育一段时间，使标记抗体与细胞表面结合。

三、流式细胞术操作1.调整流式细胞仪参数：根据实验需求，设置细胞悬液的流速、激光功率、波长和光电倍增管放大倍数等参数。

2.流式细胞术管套的准备：取一个净化过的管套，用流式细胞术管套清洁剂反复洗涤，然后用蒸馏水清洗，最后用细胞稀释液冲洗一遍。

3.样本装入：将已标记好的细胞悬液加入清洗过的流式细胞术管套中，再用细胞稀释液冲洗一下，确保样本进入流式细胞仪前不会发生凝集或沉淀。

4.样本检测：将样本放入流式细胞仪中，启动仪器开始检测。

通过选择适当的波长和参数，记录并分析细胞的标记情况，如荧光强度、细胞计数、细胞大小等。

5.数据分析：根据实验需求，使用相关软件对所得的数据进行处理和分析，生成数据图表和归纳、总结实验结果。

四、实验结束与清洁1.实验结束：在完成实验后，将仪器设置恢复到初始状态，关闭仪器和电源，清理工作台和废弃物。

2.仪器清洁：使用适当的清洗剂和纯水，清洁仪器内部和外部的各个部分，如样品流路、流式细胞仪的探头等，确保仪器干净整洁。

3.数据保存：将实验所得数据保存到与实验相关的记录文件夹中，以备后续数据分析和验证。

以上是流式细胞术的操作规程。

在进行实验前，要确保仪器的正常运行和合适的细胞标记试剂的选择，严格按照操作规程进行操作，保证实验的顺利进行和数据的准确性。

单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
1.取外周血20mL，转移至250mL无菌生理盐水瓶中，加20mL生理盐水混匀，按照体积比3：1加入羟乙基淀粉，即加入13.5mL羟乙基淀粉，充分摇匀后，室温静置15min。

此时加上操作，一共需要耗时25min。

2.吸取上层清亮溶液至50mL无菌离心管，20℃，1800rpm，离心5min，弃上清，最后用10mL生理盐水重悬细胞。

此时加上操作，共耗时25min。

3.吸取提前预热至室温的Ficou人淋巴细胞分离液10mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢加入到分离液中，室温，2000rpm离心25min。

此时加上操作，共耗时35min。

4.小心吸取中间白膜层置于另一无菌15mL离心管，加生理盐水补足体积至
13mL，吹打混匀，室温，1800rpm离心5min，弃上清液，然后再重复该步骤1次。

此时加上操作，共耗时20min。

5.用500微升生理盐水重悬，稀释100倍进行细胞计数，吸取合适数量的细胞进行流式标记（共分为23个流式标记管，至少需1.15×107细胞），每管50微升孵育体积，每种抗体加入1.5微升，全部加完后用中枪混匀，放于4度冰箱孵育30min，并每10min弹匀一次。

此时加上操作，共耗时80min。

6.取出孵育完毕的抗体，用PBS清洗两次（2000rpm离心5min），最后用200微升PBS重悬。

此时加上操作，共耗时40min。

7.将样品拿至流式检测室过筛网，上机检测。

此时加上操作，共耗时45min。

8.关机及出流式报告，30min。

流式细胞仪实验流程英文回答：Flow cytometry is a powerful technique used in biological research to analyze and sort cells based ontheir physical and chemical properties. It allows researchers to study various aspects of cells, such as cell size, shape, granularity, and protein expression. Here, I will explain the general workflow of a flow cytometry experiment.1. Sample preparation: The first step is to prepare the cell sample for analysis. This involves isolating the cells of interest from tissues or cultures and ensuring their viability. The cells are then washed and resuspended in a buffer solution to maintain their physiological conditions.2. Instrument setup: Once the sample is ready, the flow cytometer needs to be properly set up. This includes calibrating the instrument using calibration beads toensure accurate measurements. The laser and detector settings are adjusted to detect the specific fluorochromes used for labeling the cells.3. Cell labeling: To analyze specific cell populations, cells are often labeled with fluorescent markers. These markers can be antibodies that bind to specific cell surface proteins or dyes that stain cellular components. The choice of markers depends on the research question and the cell types being studied.4. Data acquisition: The labeled cells are introduced into the flow cytometer, where they pass through a narrow flow cell one at a time. As the cells flow through the laser beam, the fluorochromes emit light signals that are detected by the instrument. The emitted signals are converted into electronic signals and recorded as data.5. Data analysis: Once the data is acquired, it needs to be analyzed to extract meaningful information. Flow cytometry software is used to analyze the data and generate graphical representations. Various parameters can bemeasured, such as cell population frequencies, cell cycle distribution, and protein expression levels.6. Cell sorting (optional): In some cases, flow cytometry is used for cell sorting, where specific cell populations are physically separated based on their properties. This is achieved by applying an electric charge to the cells as they pass through the flow cell. The charged cells are then deflected into different collection tubes, allowing researchers to isolate and study specific cell populations.Overall, flow cytometry is a versatile technique that provides valuable insights into cellular characteristics and functions. It is widely used in immunology, cancer research, stem cell biology, and many other fields.中文回答：流式细胞仪是一种在生物研究中广泛应用的技术，可以根据细胞的物理和化学特性对其进行分析和分选。

流式细胞术检测流程流式细胞术检测的对象一般是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，如果要检测组织中的细胞，则必须先将组织制备成单细胞悬液，而后方可进行检测。

制备基本流程如下：1.细胞的培养、制备将一定数量的单个细胞收集于1.5mL的EP管中，2400rpm、4℃离心4min，弃上清；加入1xPBS清洗，同等条件进行离心，弃上清。

2.封闭用来标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体，少数也可能是多克隆抗体，但其基本结构都是由两部分组成：包含有特异性结合抗原位点的Fab段、相对保守的Fc段。

抗体的特异性表现在Fab段，标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子进行特异性结合，从而进行标记并且相对量化的展示了细胞表达该抗原分子的情况。

3.荧光素偶联抗体标记以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例，一般染色体系推荐100μl，CD3、CD4表达量相对较高，1μl足够了，假如有9个样本，分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混匀后，分别取100μl加到9个样品孔中，混匀，室温、避光染色20min。

时间到后加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体，2400rpm、4°C离心4min，弃上清，加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀，并尽快上机分析。

4.光电倍增管电压的设定上机分析时，在确认机器没有问题后，需调节每个通道的光电倍增管的电压，从而区分细胞群，利用FSC和SSC，通过调节FSC和SSC的电压，区分淋巴细胞亚群，使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。

FSC和SSC的电压确定之后还需调节APC-cy7、FITC的电压，使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。

5.设置对照，补偿调节流式实验中对照设置很重要，常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。

临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。

抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃2：全血溶血试剂A：甲酸70ML 室温B：碳酸钠等32ML 室温C：多聚甲醛14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞仪检测步骤4.15流式细胞检测的步骤【人乳腺癌贴壁细胞流式检测】一、细胞铺板1.调整细胞浓度2.5×105，加2ml培养液于六孔板中置于培养箱中过夜，铺两板，次日加药,分别作用24h和48h。

2.分组设定：调补偿组：空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组实验组(FITC +PE组)：贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组实验组中每组检测两次.二、流式样品准备1.消化：选取处于对数生长期的细胞，收集旧培养基，培养基离心。

离心完毕后，离心管中剩2ml液体。

用来贴壁细胞的终止消化。

贴壁细胞用200ul 0.25%胰蛋白酶消化，消化5分钟，然后加2ml离心过的培养基终止消化。

2.离心：800r/min ,离心5min，弃掉上清液。

3.重悬：加2ml PBS重悬，涡旋成单细胞悬液。

将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。

加300ulPBS重悬细胞。

4. 调补偿组：分别吸取贴壁细胞50ul细胞悬液于四个流式管中（此时细胞数至少为1×106/ml以上），分成四组，即空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO 组，FITC组，PE组。

实验组（(FITC +PE组): 贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组。

实验组中每组检测两次，故每组分别吸取50ul细胞悬液于两个流式管中。

空白对照组什么也不加，剩下的每组加相应的抗体10ｕl。

常温避光孵育20min。

5.孵育完成后，加1mlPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。

6.离心后垂直倒掉上清液,再加200ulPBS重悬细胞，进行上机检测。

三、操作注意1.消化细胞时要让胰酶自然消化，最好不要人工拍打，否则会成片脱落，影响结果的测定。

上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。

2.垂直倒掉上清液后，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。

3.上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光。

流式细胞术检测Fluo 4
一、所需材料：PBS，胰酶，Fluo 4，终止消化液（PBS+1%血清）
二、操作步骤
1.6孔板中培养细胞，加药处理24h后，pbs洗3次。

配置2uM Fluo 4稀释液（每1mlPBS加1ul Fluo4），每孔1ml，37℃孵育1h。

2.PBS洗3次，0.8ml胰酶消化1min，吹下来。

0.5ml终止消化液（PBS+1%血清）终止消化（这一步要求总体积不超过1.5ml）。

3.转移至1.5ml EP管，上机检测。

三、备注：
1.终止消化后直接上机：离心麻烦。

胰酶消化后，加入无色的终止消化液，不用离心（离心的目的是去除完全培养液的颜色、血清中的各种蛋白质）。

使用分子生物的离心机3000r，5min，发现细胞贴在壁上，不会沉积在底部。

2.上次对比含/不含酚红的流式检测结果，差别不大。

说明上机的液体是红色的培养液时，不会影响检测结果。

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。