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口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）使用说明书【产品名称】通用名：口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Asia O（ELISA）【包装规格】96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒【预期用途】口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其特征为口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。
本试剂用于检测牛、羊、猪血清中口蹄疫O型抗体，可用于口蹄疫O型疫苗免疫效果评价。
【原理】本试剂盒由预包被口蹄疫O型抗体的酶标板、抗体工作液、抗原液、酶标记物及其他配套试剂组成，应用阻断酶联免疫法（ELISA）原理检测牛、羊、猪血清样本中口蹄疫O型抗体。
实验时将稀释的样本与抗原液同时加入酶标板中孵育，样本中的抗体与酶标板上的抗体竞争抗原，阻断抗原与板的结合；经洗涤后，再加抗体工作液孵育；经洗涤后加入酶标记物孵育；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加底物液，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成负相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有口蹄疫O型抗体。
【试剂盒组成】【储存及有效期】2～8℃保存，有效期12个月。
包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。
使用期限为2个月。
【适用仪器】含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。
【样品准备】1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。
样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。
2.用工作洗涤液将待检牛、羊血清先按32倍稀释（如5μl 血清加入155μl 工作洗涤液中，混匀），待检猪血清按16倍稀释（如5μl 血清加入75μl 洗涤液中，混匀），阴、阳性对照不用稀释。
血凝试验监测家畜Ｏ型口蹄疫免疫抗体摘要对湟中县猪、牛、羊口蹄疫免疫抗体进行检测，结果表明猪的免疫抗体合格率较低，并分析了其原因。
关键词家畜O型口蹄疫；免疫抗体；血凝试验口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄动物一种急性、烈性、高度接触性传染病，对人类也有一定的感染性。
口蹄疫的危害在于其传播途径多，传染性强，近年来，在一些欧洲和亚洲国家相继发生流行，严重影响了畜牧业的发展和动物及动物产品的国际贸易。
国际兽医局（OIE）将其列为A类传染病首位，我国也将其列一类传染病。
为了尽快扑灭此病，国家对口蹄疫实行强制免疫。
为了解和掌握口蹄疫免疫效果，我站于2007年12月对我县猪、牛、羊口蹄疫免疫抗体进行检测，现报告如下。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1灭活疫苗。
猪口蹄疫O型灭活疫苗，批号：070604，生产厂家：中牧实业股份有限公司兰州生物药厂；牛、羊口蹄疫O型、亚洲I型二价灭活疫苗，批号：070876，生产厂家：中农威特生物科技股份有限公司。
1.1.2血清样品。
采自全县15个乡镇，其中猪、牛、羊血清分别为129份、140份、131份；抽检样品均于10月15日至11月15日期间免疫接种，采样日期为12月2～5日。
1.1.3诊断试剂及主要仪器。
口蹄疫O型正向血凝抗原，批号：071018；阴性血清，批号：070918；口蹄疫O型阳性血清，批号：070729；稀释液，批号：07113；生产厂家：中国农科院兰州兽医研究所提供；主要仪器有水浴锅、微量振荡器、96孔110℃V型板、单道、多道移液器等。
1.2试验方法1.2.1操作方法。
①加稀释液。
在血凝上1~6排的1~9孔；第7排的1~4孔、第6~7孔；第8排的1~12孔各加稀释液50μL。
②稀释待检血清。
取1号待检血清50μL加入第1排第1孔，并将吸头插入孔底，右手拇指轻压弹簧1~2次混匀，从该孔取出50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3孔直至第9混匀后取出50μL丢弃。
正向间接血凝试验监测家畜Ｏ型口蹄疫抗体摘要有效控制口蹄疫关键在于早期监测，准确监测是防制口蹄疫的重要环节。
特对某地方乡镇散养、规模化养殖场采取牛、羊、猪的血清，利用正向间接血凝试验对家畜O型口蹄疫疫苗免疫抗体进行监测，了解家畜免疫效果。
监测结果显示，该地方牛羊的口蹄疫疫苗免疫合格率平均为76%，猪的口蹄疫疫苗免疫合格率平均为60%；规模化养殖场较个体散养户免疫抗体效果好；牛口蹄疫O 型灭活苗的免疫抗体效果好于牛口蹄疫AsiaⅠ-O型双价灭活疫苗的免疫抗体效果。
关键词正向间接血凝试验；监测；O型口蹄疫；抗体口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病。
该病可快速和远距离传播，易感动物主要包括猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生偶蹄动物。
FMD也可感染人，但病例很少，表现轻微。
FMD的发病率为100%，死亡率因病毒株而异，严重时可达100%。
由于口蹄疫对畜牧业的危害和对一个国家的经济、政治的影响，各国都积极采取了预防和控制该病的措施。
口蹄疫的有效控制关键在于早期检测，准确的检测是防制口蹄疫的重要环节。
笔者利用正向间接血凝试验对家畜O型口蹄疫疫苗免疫抗体进行监测。
1材料与方法1.1材料1.1.1仪器。
96孔110°V型医用血凝板、微型振荡器、微量移液器（50μL、25μL）、取液塑料咀（枪头）。
1.1.2药品。
①口蹄疫血凝抗原。
2005年批号051129，2006年批号060524，2007年批号070576。
购自中国农业科学院兰州兽医研究所综防技术研究组。
②口蹄疫阴性对照血清。
2005年批号050915，2006年批号060225，2007年批号070405。
购自中国农业科学院兰州兽医研究所综防技术研究组。
③口蹄疫阳性对照血清。
2005年批号050726，2006年批号060223，2007年批号070120。
购自中国农业科学院兰州兽医研究所综防技术研究组。
一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。
现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。
1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。
病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。
2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。
灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。
当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。
然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。
中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。
2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。
硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
检测口蹄疫血清抗体的方法（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。
该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。
1．试验材料 V型96孔110。
医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径1.5毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。
2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。
（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。
①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。
此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。
②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。
③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升加入第1管混匀后从中取出0.5毫升，加入第2管混匀后从中取出0.5毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。
④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。
“O ”型口蹄疫正向间接血凝试验的操作体会闫小芹1，邵喜成2，李知新1，赵燕1（1.宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川750002；2.宁夏西吉县动物疾病预防控制中心，宁夏西吉756200）摘要：“O ”型口蹄疫正向间接血凝试验是一种微量的体外免疫反应，主要利于抗原、抗体在一定条件的特异性反应形成抗原-抗体复合物，由于该复合物微小，所以采取先将抗原与红细胞结合，再让其与特异性抗体反应，使带有抗原的红细胞出现凝集现象，从而利用凝集现象进行免疫效果的判断。
论述了“O ”型口蹄疫正向间接血凝试验的操作体会。
关键词：“O ”型口蹄疫；正向间接血凝中图分类号：S854.43文献标识码：A 文章顺序编号：1672-5190（2011）06-0123-01正向间接血凝试验为一种微量的体外免疫反应，主要利于抗原与抗体在一定条件下的特异性反应，从而形成抗原－抗体复合物，由于该复合物微小，所以采取先将抗原与红细胞结合，再让其与特异性抗体反应，使带有抗原的红细胞出现凝集现象，这样，就可以观察到明显的抗原与抗体的反应，同时还提高了抗原与抗体反应的敏感性。
在实际操作中，笔者通过不断摸索，得出如下几点操作体会，现总结如下。
1原理在口蹄疫正向间接血凝试验中，经过FMD 抗原致敏红细胞与FMD 抗体相遇，红细胞出现清晰的凝集现象。
根据出现凝集滴度，判定待检血清的抗体效价。
2试验材料96孔1100V 型血凝板、封板膜；移液枪（50μL/25μL ）、微液枪尖；微量振荡器；口蹄疫“O ”型血凝抗原；口蹄疫“O ”型对照血清（阴性），口蹄疫“O ”型对照血清（阳性）；间接血凝试剂盒稀释液；待检血清（每头约0.5mL 即可）。
3试验方法①在反应板上前6排的前9个孔；第7排的前7个孔；第8排的前12个孔均加入50μL 的稀释液。
②稀释血清后，取实验1组的血清50μL 加入1.1（第1排第1孔，以后编号如此小数点左侧为排数，右侧为该排的孔数），反复吹打，之后从该孔中吸取50μL 打入1.2吹打混匀，依次倍比稀释至第9孔，混匀后弃取50μL 。
检测口蹄疫血清抗体的方法（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。
该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。
1．试验材料V型96孔110。
医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。
2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。
（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。
①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。
此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。
②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。
③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。
④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。
毕节市动物疫病预防控制中心
兽医实验室
标准操作规程
题目: O型口蹄疫反向间接血凝试验
编号：BJSCAD/CX13-006-2010
起草者：日期：年月日
审修者：日期：年月日
批准者：日期：年月日
生效日期：年月日
O型口蹄疫反向间接血凝试验
一目的
为规范O型口蹄疫反向间接血凝试验的检验检测技术，保证检测结果的真实性、科学性、准确性，特制订本标准操作规程。
二试验准备
器皿：微量振荡器、50ul移液枪、V型96孔凝集板、枪头。
试剂及样本：O型口蹄疫标准抗原、O型口蹄疫诊断液、稀释液、口蹄疫待检血清。
三试验程序
1. 待检抗原的稀释：取V型96孔凝集板，从第1~9孔分别加入稀释液各50ul，然后于第1孔加入待检抗原50ul，用移液枪稀释后吸取50ul加入第2孔，如此稀释到第8孔，最后弃去50ul；留第9孔作阴性对照；第10孔加入口蹄疫标准抗原50ul，做阳性对照。
2. 滴加红细胞诊断液：用时先将O型口蹄疫红细胞诊断液摇匀，从第1~10孔分别加入诊断液50ul，于微量震荡器轻轻振荡，使红细胞均匀分布，室温放置1.5h~2h后观察判定结果。
口蹄疫O型间接血凝抗体检测试验
一、原理：
用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。
抗原与其对应的抗体相遇，在一条件下形成抗原—抗体复合物。
但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。
将抗原吸附（致敏）在红细胞表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测免疫动物血清中的口蹄疫抗体水平。
这种经过口蹄疫抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰的凝集现象。
二、主要组分：
1．口蹄疫O型血凝抗原5ml/瓶，5瓶/盒；
2．口蹄疫O型阳性对照血清0.5ml/管，1管/盒，阳性血清已1:4稀释；
3．口蹄疫O型阴性对照血清0.5ml/管，1管/盒；
4．稀释液50ml/瓶，2瓶/盒；
5．封板膜10张/盒。
三、试验器材：
1．96孔110°V型医用血凝板；
2．8道或12道移液器；
3．微量振荡器。
四、物理性状：
1．抗原摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底；
2．阴性对照血清淡黄色清亮稍带粘性的液体；
3．阳性对照血清微红或淡黄色稍浑浊带粘性的液体；
4．稀释液淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。
五、作用与用途：
用于检测口蹄疫O型疫苗免疫动物血清抗体效价。
六、用法与判定：
1、用法
1.1加稀释液
在血凝板上1～7排的1～10孔、第8排的1～4孔和第5～7孔；加稀释液50μl/孔。
1.2稀释待检血清
待检血清使用前，需经过56℃水浴灭活30分钟，取待检灭活血清样品50μl，分别加入反应板1～6排的第1孔中，与稀释液混匀后，吸取50μl，加于第2孔中，依次作2倍系列稀释至第10孔，第10孔混匀后取出50μl弃去。
1.3稀释阳性对照血清
在血凝板的第7排第1孔加阳性血清50μl，2倍系列稀释至第10孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。
此时被检血清和阳性血清的稀释倍数依次为1:2～1:1024。
1.4稀释阴性对照血清
在血凝板上的第8排第1孔加阴性血清50μl，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μl丢弃。
此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2、1:4、1:8、1:16。
第5～7孔为稀释液对照，每孔仅加入50μl稀释液。
1.5加血凝抗原
血清稀释孔和稀释对照孔加血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25μl/孔。
将反应板置微型振荡器上震荡2～3分钟或用手依次四边轻拍，直至血球分布均匀。
封板膜封板，室温下静置2～3小时判定结果，也可延至翌日判定。
2、判定
以呈现“＋＋”血凝反应的血清最高稀释度作为该血清的间接血凝抗体效价。
血凝反应强度表示如下：
“＋＋＋＋”红细胞全部凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底。
“＋＋＋”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者略小。
“＋＋”红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状。
“＋”红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。
“±”红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。
“—”红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。
当阳性血清抗体效价≥1:256、阴性血清抗体效价≤1:16、稀释液对照孔无自凝现象时，试验成立。
接种口蹄疫O型疫苗的猪免疫抗体效价≥1:128为免疫合格，牛羊免疫抗体效价≥1:256为免疫合格。
七、注意事项：
1．为使您的实验获得正确结果，请您在实验前仔细阅读本说明书；
2．收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果；
3．勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果；
4．严重溶血或严重污染的血清样品不易检测，以免发生非特异性反应；
5．每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照；
6．用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。
再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水分放37℃恒温箱内干燥备用。
检测用具应煮沸消毒，37℃干燥备用。
血凝板应定期浸泡在洗液中也可浸泡在5%盐酸液内，48小时取出后清水冲净。
