酶联免疫吸附实验培训课件

特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
例如乙肝病毒中的 表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗 体（HBcAg），虽来源于 同一病毒，但仅与其相 应的抗体结合，而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某 一特定的物质，而不需 先分离待检物。
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
用已知特异性 抗体包被 固相载体
河豚毒素
苯并芘
ELISA在疾病诊断中的作用 ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用 检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2 ）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体
Hale Waihona Puke ELISA法检测幽门螺杆菌抗体ELISA试剂盒商业资讯
ELISA试剂盒
酶联免疫井
几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
参考文献：
《生物体系中的化学测量》 Kent k.Stewart Richard E.EBEL 著 生命经纬
/sky/nyxkc/techology.html

酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
4. 原理（以间接ELISA为例）：
显色
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
实验材料
猪瘟病毒（CSFV） —— 抗原 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB ，底物缓冲液，30% H2O2 酶标板，酶标仪
• 分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)
1.定义
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连
（3）双抗体夹心法测定抗原
A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体;
E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
（4）竞争法测定抗原
A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次在干净吸水纸上 拍干。
3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。 5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟

（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：

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原理及特点 抗原抗体反应的特异性
+ 酶高效催化反应的专一性
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原理及特点
原理： ➢酶标抗体（抗原）与抗原（抗体） 的特异性反应 ➢酶对底物的显色反应 ➢对抗原或抗体进行定位、定性或 定量的测定分析
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2 酶免疫技术是根据何种特性分为均相和异相的（ ） A 抗原特性 B 抗体特性 C 抗原抗体反应后是否需要分离结合和游离酶标记物 D 酶的稳定性 E 载体特性
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原
物）的测定
理 酶标记物与相应的抗原或抗体结
合后，标记酶的活性会发生改变，
不用分离结合和游离酶标记物，通
过测定标记酶的活性的改变，而确
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1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶 （ALP) 3.β-半乳糖苷酶 (β-Gal)