检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验

十六、乙型脑炎检测方法猪乙型脑炎乳胶凝集试验（LAT）诊断试剂盒使用说明书猪乙型脑炎是由流行性日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的猪的一种繁殖障碍性疾病。

此病引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪睾丸肿胀，萎缩、丧失配种能力及新生仔猪痉挛死亡。

临床上该病多呈散发，流行常发生于蚊虫滋生的炎热季节，，患畜病初体温升高、精神沉郁、跛行、有神经症状，病愈后隐性带毒，种猪表现繁殖障碍，该病给养猪业带来较大的经济损失。

猪乙型脑炎乳胶凝集试验是用乙脑弱毒疫苗毒株经纯化、浓缩等程序后致敏乳胶，制成乳胶凝集试验用抗原，用于检测动物血清中的乙脑病毒抗体，可在现场进行，具有安全、简便、快速、特异、敏感之优点。

1．试剂盒的内容：本品包括猪乙型脑炎致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液、玻片、吸头及使用说明书。

2．制品用途：用于猪乙脑血清学诊断。

3．使用方法：3．1 定性试验：取待检样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴（约15微升左右），分别置于玻片上，再各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1~2分钟，于3~5分钟内观察结果。

3．2定量试验：先将血清作连续稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。

4．结果判定：4．1对照试验：出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“—”；抗原加稀释液呈“—”。

4．2 判定标准：“++++”全部乳胶凝聚，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“++”约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“+”有少许凝集，液体呈混浊；“—”液滴呈原有的均匀乳状。

以出现“++”以上凝集为阳性。

5.贮藏:在2-8℃冷暗处保存，有效期暂定1年。

6.附注：被检样品采集及处理方法。

6．1 血清：按常规方法分离血清，要求无腐败。

6．2 使用前应轻轻摇匀乳胶抗原。

检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验摘要：在亚洲，乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病因，据统计，每年大约有45000例病例。

它导致显着的发病率和死亡率。

乙型脑炎病毒主要通过库蚊在鸟类和动物之间传播，而人类被认为是其终末宿主。

由于登革热在乙型脑炎流行地区也很普遍，因此必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实乙型脑炎阳性血清。

噬斑减少中和试验是检测以及量化乙型脑炎病毒中和抗体的黄金标准。

然而，噬斑减少中和试验大约需要一个星期，并且在在6个或24孔板中进行，这对于大规模筛选具有局限性。

因此有必要开发一种可用于检测和定量乙型脑炎病毒中和抗体的简化方案。

该法在96孔板中进行，将适合用于大规模筛查人群的免疫水平以及疫苗的免疫效力研究。

关键词：乙型脑炎病毒；中和抗体；酶联免疫引言在亚洲，主要由节肢动物传播的乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病原。

据统计，每年大约有45000个病例，死亡率为25%;并且有高达50％的患者留有神经系统后遗症（世界卫生组织，1996年）。

乙型脑炎病毒为RNA正链病毒，属于黄病毒科。

病毒发生表现有地方性周期性特点，库蚊和猪为其主要的宿主，病毒在其体内大量复制。

然而，人类被认为是其终末宿主。

（Sabchareon和Yoksan，1998）在亚洲许多地方乙型脑炎病毒都有流行，往往在这些地方都伴随有登革热病毒流行。

因此，为了与登革热区分，就必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实其确为乙型脑炎病毒阳性血清。

此外，检测中和抗体也可作为检测乙型脑炎疫苗效力的合理的替代措施。

（Markofff L.，2000）。

“斑减少中和试验是检测和量化乙型脑炎病毒中和抗体的标准方法（Shyu等.1997）。

然而，斑减少中和试验需要一周才能完成并且仅在6或24孔板中进行，从而对于大规模的筛选表现出一定的局限性，在疫苗的效力学研究以及血清流行病学调查方面其局限性表现得更加突出。

结果通过肉眼计数斑块的数量来获得，而这，也有一定的主观偏差。

乙型脑炎的检查1.血象：白细胞计数一般在10～30×109/L，中粒细胞增至80%以上，核左移，嗜酸粒细胞可减少。

2.脑脊液检查：外观澄清或微混，白细胞计数增加，多数在0.05～0.5×109/L之间，个别病人可达1×109/L以上，或始终正常；在病初以中性粒细胞占多数，以后逐渐以淋巴细胞为多。

蛋白稍增加，糖定量正常或偏高，氯化物正常。

脑脊液中免疫球蛋白的测定对鉴别诊断有帮助。

化脓性脑膜炎患者脑脊液中的IgM明显升高，结核性脑膜炎患者则IgA、IgG升高显著，而病毒性脑膜炎患者在后期时IgG可有升高。

3.血清学检查：（1）血凝抑制试验：可测定IgM抗体及IgG抗体，敏感性高，方法简便快速，但试验要求严格，偶见假阳性反应。

双份血清效价增长4倍以上可确诊，单份血清抗体效价1：100为可疑，1：320可作诊断、1：640可确诊。

（2）二巯基乙醇（2ME）：耐性试验检测IgM抗体，患者血清标本在2ME处理前、后分别作血凝抑制试验，如处理后血凝抑制抗体效价下降1/2～3/4，表示特异性Ig M已被2ME裂解，即为试验阳性。

本法可在起病第4～8天即呈阳性，且由于单份血清即有辅助价值，故可对乙脑进行早期诊断。

（3）补体结合试验：特异性较高，但其阳性大都出现在第4～7周，双份血清抗体效价有4倍或以上的增长即可诊断。

若仅单份血清，1：2为可疑，1：4以上有助诊断。

（4）中和试验：病后一周血中出现中和抗体，效价增长4倍以上可确诊。

早期为IgM，后期为IgG.此法特异性及敏感性均较高，抗体持续终生。

一般用于流行病学调查。

（5）免疫荧光试验：发病初1～2天的血液或发热第2～4天的脑脊液及发热全程的脑室内的脑脊液，均可采用本法检测乙脑病毒抗原，方法快速，阳性率高，有早期诊断价值。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：一般用于测定血清中的乙脑抗体，比较灵敏、特异。

4.病毒分离：病初可取血清或脑脊液接种乳鼠以分离病毒，但阳性率较低。

全国乙型脑炎病毒检测技术规范(2023年修订版)1. 引言本文档为全国乙型脑炎病毒检测技术规范的修订版，用于指导乙型脑炎病毒的检测工作。

本规范适用于各种检测方法，包括实验室和临床现场检测。

2. 检测方法选择乙型脑炎病毒检测方法应根据检测目的、设备和人力资源等实际情况进行选择。

常用的检测方法包括：- 病毒分离与培养法- 分子生物学方法- 免疫学方法- 细胞培养-PCR方法3. 仪器与试剂3.1 仪器乙型脑炎病毒检测仪器应具备以下特点：- 准确可靠- 高效快速- 具备自动化分析功能- 易于操作和维护3.2 试剂使用的试剂应符合以下要求：- 高纯度- 无污染- 有效期内- 适用于特定检测方法4. 采样与保存4.1 采样采样时应遵循以下原则：- 采样部位应选择合适的组织或分泌物，如脑脊液、血液等- 要采集足够的样本量，以保证后续检测的准确性和可靠性- 避免样本污染，使用消毒的采样器具- 存储样本的应具备防漏和防污染的功能4.2 保存保存样本时应注意以下事项：- 样本应保存在低温条件下，常见温度为-70°C。

- 不同类型的样本应分别保存，避免混淆和交叉污染。

- 样本应密封，避免温度变化和氧化损害。

5. 检测流程与步骤乙型脑炎病毒检测应按照以下流程进行：5.1 样本处理- 样本接收与登记- 样本稀释或净化- 样本裂解处理5.2 样本检测- 样本制备- 抗原或核酸提取- 检测方法操作5.3 结果判读与分析- 结果读取- 结果分析与判定- 结果记录与报告6. 质量控制与质量保证6.1 质量控制- 设定质控样本- 检测过程中加入质控样本进行验证- 记录质控样本的检测结果6.2 质量保证- 定期进行仪器校准和验证- 培训检测人员，提高技术操作水平- 定期进行质量评估和内部审核7. 数据管理7.1 数据采集实施标准化的数据采集流程，确保数据的准确性和完整性。

7.2 数据存储与分析建立合适的数据库进行数据存储和分析，包括样本信息、检测结果和质控数据等。

乙型脑炎病毒NS1基因原核表达及脑炎抗体检测方法的初
步研究的开题报告
一、研究背景和意义
乙型脑炎是一种重要的人畜共患传染病，主要由乙型脑炎病毒引起，病死率较高，对人口健康和农业发展造成重大威胁。

目前，乙型脑炎的诊断主要依靠病毒分离和抗
体检测，但分离病毒需要耗费大量时间和精力，而抗体检测则无法准确判断病毒感染
的早期阶段。

因此，寻找新的乙型脑炎诊断方法是很有必要的。

NS1是乙型脑炎病毒的一个非结构蛋白，广泛存在于感染细胞的早期和晚期，且在血清中的含量较高。

因此，NS1可以作为乙型脑炎病毒感染的早期指标，并且由于
其原核表达便捷、纯化简便，因此可以作为一种新的诊断方法开发。

二、研究内容和方法
本研究旨在通过原核表达方法获得乙型脑炎病毒NS1蛋白，并利用该蛋白制备
抗体以开发NS1抗体检测方法。

主要研究内容如下：
1.基因克隆
根据文献报道的NS1基因序列，设计引物，利用PCR扩增NS1基因，并将其连接至原核表达载体中。

2.原核表达与纯化
将NS1原核表达载体转化至大肠杆菌中，在含IPTG的培养基中诱导表达并纯化NS1蛋白。

3.制备抗体
用纯化的NS1蛋白免疫Balb/c小鼠，获得抗NS1蛋白的多克隆抗体。

4.建立NS1抗体检测方法
利用ELISA方法，验证获得的抗NS1蛋白多克隆抗体的特异性和敏感性，并建
立NS1抗体检测方法。

三、预期结果和意义
本研究预计可以开发出一种快速、准确、灵敏的NS1抗体检测方法，用于早期诊断乙型脑炎病毒感染。

此外，该研究的方法也为其他病毒的早期诊断奠定了基础，具有重要的应用前景和推广价值。

也 更 适 于 常 规 应 用
次 ＨＩ 聚 合 酶 链 反 应 定 性 分 析 的 费 ｖ
用 是 一 次 ＨＩ Ｅ Ｓ 的 ｌ Ｖ ＬＩＡ ｏ倍 。 Ｖ ＩＡ ＨＩ ＥＬ Ｓ 定 量 分 析 的 结 果 和 临 床 检 查 相 结 合 可 能 为 诊 断 婴 儿 期 ＨＩ 感 染 的经 济 方 法提 供 基 础 。 ｖ 采 用 此 法 可 使 ７ 由 ＨＩ 感 染 母 亲 所 生 的 婴 ０ Ｖ
Ｌｇ ｔ ｉｈ 膜盒 中 ｌ 分钟 病 灶显 现 为分散 的深 ０ 色 斑 点 ， 果 显 示 为 病 毒剂 量 依 赖 型 。 于 致 结 对
细 胞 病 变 ＨＡＶ， 斑 计 数 与 ＬＩ Ａ 结 果 相 空 Ｆ 似 ， 空斑 比病 灶 更 小 更 难 以 识 别 。 每 三个 但 在 平 板 中 检 测 到 ２ 个 空 斑 ， 均 直 径 为 ５ 平 ５７ ｍ｝ 每 三个膜 中 检测 到 ２ ．ｒ 在 ａ ５个 病 灶 ， 平 均 直 径 为 ８８ ．ｍｍ。 ＲＶ 在 Ｆ Ｋ一 Ｒｈ ４和 ＭＡ一 １４细 胞 中 均 未 产 生 空 斑 ， ＬＩ Ａ 却 能 定 ０ 而 Ｆ 量 检 出病 毒 感 染 灶 。由此 可 见 ， Ｉ Ａ 在 确 定 ＬＦ 和 计 数 小 的 感 染 灶 方 面 比空 斑 分 析 更 灵 敏
０ ５ 检 测乙 型 脑炎 病毒 中和抗体 的 简 化试 ２ 验 ［ ］ ＴｉｇＳ 英 ／ ｒ ＨＬ… ∥ ＪＶｉ ｌＭｅｈ ￣ ｒ ｔ— ｏ
ｏ ｓ ２ ０ ， ３（ － ） 一 ３ ４ ｄ ． ０ １ ９ １２ ．４ ～ ７
在 亚 洲 乙 型 脑 炎 （Ｅ） 毒 是 病 毒 性 脑 Ｊ 病 炎 的 常 见 原 因 ， 计 每 年 有 ４ ０ ０例 病 倒 ， 估 ５０ 并 且发病率 和病死率较 高 。 由 于 登 革 热 也 在 Ｊ 流 行 区 流 行 ， 此 Ｅ 因 为 了 与 登 革 热 区 分 ， 有 Ｊ 阳 性 血 清 必 须 所 Ｅ 检测 Ｊ Ｅ特 异 性 中和 抗 体 才 能 确 诊 。蚀 斑 减 少 中 和 试 验 （ ＲＮＴ） 定 量 检 测 Ｊ 中 和 抗 Ｐ 是 Ｅ 体 的 金 标 准 。 而 该 方 法 需 在 ６孔 或 ２ 然 ４孔 板 上进 行 ， 时 ｌ周 ， 样 就 限 制 了其 在大 规 模 需 这 筛 选 ， 其 是 在 疫 苗 效 力 研 究 和 血 清 流 行 病 尤 学调 查 中的 应 用 。 因此 ， 目前 已 建立 了 几 种 改 进 的 定量 检 测 Ｊ 中和 抗 体 的 方 法 。 Ｅ 微 灶减 少 中和试 验 和 荧光灶 抑制 试 验 ， 应 用 过 氧 物 酶 结 合 抗 体 、 色 技 术 和 荧 光 显 染

第八届中国北方实验动物科技年会论文集
１．１．２质粒
含乙脑病毒衣壳蛋白ｆ基因的重组质粒ｐＴ—ＪＥＷ３１５由本实验室构建保存。
１．１．３主要试剂 乙脑病毒Ｎａｋａｙａｍａ、乙脑病毒ＳＡｌ４一１４—２、脑脊髓炎病毒（ＧＤＶＩＩ）、小鼠
脑心肌炎病毒（ＥＭＣ）、小鼠淋巴脉络丛脑膜炎病毒（ＬｃＭ）、ＢＨＫ一２１细胞由本实 验室保存。Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ—Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ、ＭｇＣｌ２、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ购自美国Ｐｒｏｇｅｍａ 公司。ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ、Ａｇａｒｏｓｅ、ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ，购自宝 生物工程（大连）有限公司。３个不同批次的乙脑病毒ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒分别 购自北京索奥生物技术有限公司和深圳绿诗源生物技术有限公司。 １．２方法 １．２．１引物设计及合成
以乙脑病毒农壳蛋白ｆ基因佧为靶基因，建立乙脑病毒ＲＴ ＰＣＲ检测方法。 对乙脑病毒Ｎａｋａｙａｍａ、乙脑病毒ＳＡｌ４—１４ ２、脑脊髓炎病毒、小鼠脑心肌炎病 毒、小鼠淋巴脉络丛脑膜炎病毒抽提的ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增。结果ｔ乙脑病 毒Ｎａｋａｙａｍａ、己脑病毒ＳＡｌ４ １４—２均能扩增出农壳蛋白ｆ基因３１５ ｂｐ特异性 条带，而脯脊髓炎病毒、小鼠腑心肌炎病毒、小鼠淋巴脉络从脑膜炎病毒均未扩
乙脑病毒在分类上属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）黄病毒属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ） 成员，基因组为单股正链ＲＮＡ，全长约１１ ｋｂ，只有１个开放读码框，其编码是由３ 个４３２个氨基酸组成的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体在宿主细胞内，在病毒自 身编码的蛋白酶（ＮＳ３）及胞内其它酶类作用下，形成３个结构蛋白（Ｃ、ｐｒｅ Ｍ／ Ｍ、Ｅ）和７个非结构蛋白（ＮＳｌ、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５），其中ｆ 基因编码衣壳／核心蛋白（ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）。Ｃ蛋白的作用是在合成部位由Ｃ端疏 水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，以便装配成核衣壳包裹 基因组，保护基因组免受核酸酶或其他因素的破坏∞１１。

流行季节前后流行性乙型脑炎病毒中和抗体及隐性感染和显性感染比值分析目的探讨流行季节前后流行性乙型脑炎病毒中和抗体及隐性感染与显性感染比值。

方法结合以往乙脑发病率对发病高、低的不同地区A、B予以整群抽样，使用微量中和试验检测乙脑病毒中和抗体。

结果A区乙脑抗体病毒中和阳性率流行季节前后分别为83.3%与84.6%，对比差异不明显（P>0.05）;GMT分别为1：27.5与1：35.9，对比差异显著（P＜0.05）。

B区则分别为26.7%与24.1%，对比差异不明显（P>0.05），GMT分别为1：3.1与1：3.2，对比差异不明显（P>0.05）。

A区小年龄组乙脑隐性感染率与发病率趋势具有一致性，高年龄组则分离。

B区为小年龄组一致，高年龄组分离。

A、B区II/AI比值分别为为115111与5944。

结论自然感染可影响人群乙脑抗体水平，且随着抗体水平的提升比值会逐渐提升，说明人体抗体水平对于显性感染与隐性感染的比值具有重要影响。

标签：流行季节;流行性乙型脑炎病毒;中和抗体;隐性感染;显性感染流行性乙型脑炎（乙脑）是一种急性中枢神经系统传染病，主要由乙脑病毒引发，可发病于人或者牲畜。

当前我国乙脑疫苗逐渐普及，乙脑发生率下降明显。

但是据调查，我国每年乙脑发病数量仍在数千左右[1]。

健康人群乙脑免疫水平主要为自然感染与免疫接种。

为对人体抗体水平产生影响的因素予以分析研究，并对目前抗体水平下经过乙脑流行季节后隐性感染/显性感染比值予以了解，同时观察有何影响因素，在流行季节前后抽群健康人群检测分析其乙脑病毒中和抗体，现将详细情况报告如下。

1 对象与方法1.1 一般对象随机抽取本市2个地区A、B，A属于乙脑高发区，B则为低发区，分为小年龄组（16岁以下）与大年龄组（46岁以上）。

对于近30d未接受过乙脑疫苗接种与从未感染过乙脑的对象在第一、二次采血期间不给予乙脑疫苗接种，在其配合调查的基础上开展调查与采血。

一、实验目的1. 学习乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）的分离和培养技术。

2. 掌握乙型脑炎病毒的鉴定方法，包括病毒颗粒的形态学观察、血清学检测和分子生物学检测。

3. 了解乙型脑炎病毒的基本生物学特性及其在疾病发生发展中的作用。

二、实验原理乙型脑炎病毒是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。

它通过蚊虫叮咬传播，感染人类和中枢神经系统动物。

本实验采用脑组织悬液进行病毒分离，并通过形态学观察、血清学检测和分子生物学检测对病毒进行鉴定。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：小白鼠脑组织、蚊子、乙脑病毒阳性血清、乙脑病毒阴性血清、乙脑病毒抗原、PCR试剂等。

2. 试剂：DMEM细胞培养液、胎牛血清、无菌水、抗生素、10% formalin、0.5%胰蛋白酶、兔抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-FITC、DNA提取试剂盒等。

四、实验方法1. 病毒分离与培养- 将小白鼠脑组织制成悬液，加入抗生素处理后进行离心。

- 将上清液接种于蚊细胞单层培养，37℃培养48小时。

- 收集蚊细胞培养上清液，重复上述步骤，直至出现典型的CPE（细胞病变效应）。

2. 病毒颗粒的形态学观察- 取CPE细胞培养上清液，用负染法进行电镜观察。

- 观察病毒颗粒的形态、大小和表面特征。

3. 血清学检测- 将病毒培养上清液与乙脑病毒阳性血清和阴性血清进行间接免疫荧光试验（IFA）。

- 观察荧光信号，判断病毒的存在。

4. 分子生物学检测- 提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增乙脑病毒基因片段。

- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断病毒的存在。

五、实验结果1. 病毒分离与培养- 经过多次接种蚊细胞培养，成功分离出病毒，出现典型的CPE。

2. 病毒颗粒的形态学观察- 电镜下观察到病毒颗粒呈球形，直径约为30-50nm，表面有突起。

3. 血清学检测- 间接免疫荧光试验结果显示，病毒培养上清液与乙脑病毒阳性血清产生明显的荧光信号，而与阴性血清无反应。

▪ 新技术特点
1.高灵敏度：新技术能够检测到极微量的乙脑病毒，有利于早 期发现和预防病情。 2.高特异性：新技术针对乙脑病毒进行设计，对其它病毒的干 扰低，避免了误诊。 3.快速便捷：新技术简化了检测流程，缩短了检测时间，提高 了工作效率。 以上内容仅供参考，如需获取更多信息，建议您查阅生物医学 领域的专业文献或咨询相关专家。
引言：乙脑病毒及其危害
引言：乙脑病毒及其危害
乙脑病毒的概述
1.乙脑病毒是一种常见的病毒，属于黄病毒科，主要通过蚊虫 叮咬传播。 2.乙脑病毒的感染会引起乙型脑炎，这是一种神经系统疾病， 严重时可导致死亡或长期后遗症。 3.乙脑病毒在全球范围内都有分布，尤其是在热带和亚热带地 区更为常见。
乙脑病毒的危害
乙脑病毒病原检测新技术开发
新技术原理与特点介绍
新技术原理与特点介绍
▪ 新技术原理
1.乙脑病毒病原检测新技术基于最先进的基因测序技术，通过 深度剖析乙脑病毒的基因结构，能够准确地识别和定位病毒。 2.新技术利用了特异性探针，能够针对性地捕捉乙脑病毒，大 大提高了检测的灵敏度和准确性。 3.新技术结合了生物信息学分析方法，能够快速处理大量的检 测数据，提高了检测效率。
▪ 数据分析与解读
1.数据记录：详细记录实验数据，确保数据的完整性和可追溯 性。 2.数据分析：运用适当的统计方法对实验数据进行分析，例如 T检验、方差分析等。 3.结果解读：根据数据分析结果，对实验结果进行合理解读， 得出结论。
实验设计与实施方法
▪ 实验验证与改进
1.实验验证：通过多次重复实验，验证实验结果的稳定性和可靠性。 2.结果比较：与其他已有检测技术进行比较，评估新开发技术的优势与不足。 3.实验改进：根据实验结果和反馈，对实验方案进行改进和优化，提高检测效果。

流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程流行性乙型脑炎（下称乙脑）灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。

用于预防乙脑。

1 毒种1.1 毒种来源P3株病毒，每3～5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3株的保护力，以了解该毒株的有效性。

P3株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。

1.2 毒种检定1.2.1 无菌试验毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。

1.2.2 病毒滴定每正代必须用体重7～9g小白鼠进行脑内滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。

1.2.3 纯毒试验生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。

所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。

中和指数必须在500以上。

生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。

1.3毒种传代分正亚代传递。

从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。

每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。

传代时选用体重7～9g健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。

1.4 毒种保存鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可使用。

亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液，分装小瓶冻存于-60℃以下，无菌试验合格后备用。

2 疫苗制造2.1 细胞制备2.1.1 地鼠选用健康地鼠。

如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。

2.1.2 细胞消化及培养取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。

用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。

营养液中牛血清含量不得超过8%。

2.1.3 外源因子检查每生产批细胞留5%（或不少于500ml）悬液作为对照细胞检查外源病毒。

该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。

流行性乙型脑炎病毒的血清学诊断(2) 血清学诊断：包括补体结合试验、血凝抑制试验以及中和试验。

血凝抑制抗体和中和抗体存在于IgM和IgG两种免疫球蛋白中，而补体结合抗体只存在于IgG部分内。

?① 补体结合试验：特异性较高，是流行病学上确认乙脑的一种常用方法。

但因补体结合抗体的出现较晚，动物大多于发病后2周左右才呈阳性反应，故只作为回顾性诊断之用。

作者等对小鼠作人工感染试验，在腹腔接种亚致死量乙脑病毒以后，补体结合抗体于接种后11～12天达阳性效价。

4匹人工感染马(见“病原性”节) 在接种后10～14天开始呈现阳性效价。

补体结合抗体在动物体内的维持时间不超过一年。

通常以被检血清1∶4稀释度呈“++”反应强度时判为阳性。

但因人及动物中隐性感染的大量存在，近年来又普遍应用疫苗接种，因此，根据单份血清的测定结果，往往不能作出肯定诊断。

只有发病早期和恢复期双份血清的抗体效价对比，才有诊断价值。

一般是在初诊时和恢复期(病后2～3周以上)各采血1次，并在同一次补体结合试验中进行测定。

如果恢复期血清比初诊血清的效价增高4倍以上，即可判为阳性，说明患畜这次发病是由乙脑引起的。

? 补体结合试验的操作方法请参阅本书第十四章。

?② 血凝抑制试验：乙脑血凝抑制抗体较补体结合抗体出现得早，一般在病后第4～5 天开始出现，病后2周左右达高峰。

作者等发现小鼠在人工接种乙脑病毒后的第7天即开始出现血凝抑制抗体。

因此，测定血凝抑制抗体可以较早地作出诊断。

关于马骡血凝抑制抗体的阳性价，国内没有标准，作者等根据疫区和非疫区乙脑流行期前后近200匹马骡血清的两次检测，初步规定1∶ 40以上的血凝抑制效价为阳性感染价。

对临床单个病例，也应按双份血清法判定，即恢复期血清的血凝抑制效价为急性期的4倍以上者才具有诊断意义。

? 由于人和动物感染乙脑病毒后，血清中最先产生IgM抗体，数周后才出现IgG抗体，此时IgM抗体已经减少乃至消失。

因此，鉴定动物血凝抑制抗体是IgM还是IgG，有着早期诊断的意义。

猪乙型脑炎痘苗和检测技术研究进展论文猪乙型脑炎痘苗和检测技术研究进展论文猪乙型脑炎又称日本乙型脑炎，由黄病毒科黄病毒属乙型脑炎病毒引起，是一种急性中枢神经系统人兽共患传染病，国际兽医局将该病列为B类传染病。

该病不仅危害集约化养猪业，造成巨大的经济损失，也影响人类健康，严重威胁公共卫生安全。

目前尚无有效的治疗方法，强化检测技术和疫苗质量的提高是控制该病的有效手段，现将猪乙型脑炎疫苗和检测技术的研究进展情况进行综述。

1 疫苗研究进展1.1 常规疫苗目前，在畜牧业生产中用于预防猪乙型脑炎的常规疫苗有灭活苗和减毒活疫苗，其中灭活苗由北农科院畜牧兽医研究所采用猪乙型脑炎强毒株WH-1株研制成功，并于1996年获准投入市场，该疫苗接种各类猪群后无应激反应、胎内感染及病毒血症，安全性好，保护率高，但是存在免疫保护期短、免疫剂量大等不足之处。

减毒活疫苗也由湖北农业院畜牧兽医研究所研发，其使用SA14-14-2毒株，经接种地鼠肾原代细胞增殖，将病毒液冻干制成。

研究表明，病毒活疫苗安全性高、免疫原性好，特别是对后备母猪及初产母猪可产生高效的细胞免疫和体液免疫。

缺点在于可能出现毒力返强，存在潜在的致病危险，同时地鼠肾原代细胞未通过WHO认证，这严重影响了疫苗的应用范围。

1.2 基因工程疫苗随着分子生物学、分子免疫学、基因工程学等生物技术的发展，科研人员对猪乙型脑炎基因工程疫苗进行了大量的研究，取得一系列成果。

近年来，科研人员采用反向遗传学基因工程技术构建嵌合病毒作为防治猪乙型脑炎的新型疫苗，即：重组嵌合病毒疫苗。

如将猪乙型脑炎病毒的E基因替换猪瘟病毒的.E基因，构建猪乙型脑炎-猪瘟嵌合病毒，免疫小鼠及猪后，均产生了乙型脑炎病毒特异性抗体。

将猪乙型脑炎病毒的prM和E基因代替黄热病毒的同种基因，构建乙型脑炎-黄热嵌合病毒，实验证明，具有较高的安全性和特异性抗体水平，免疫抗体转阳率达99.1%，并且已在澳大利亚注册成功。

一、引言流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B，简称乙脑）是由乙型脑炎病毒引起的急性中枢神经系统感染性疾病，主要影响儿童和青少年。

乙脑的病死率较高，且预后较差。

因此，早期诊断和治疗对于提高患者生存率和降低后遗症具有重要意义。

本实验报告旨在通过实验室检测，对乙脑进行诊断。

二、实验材料与方法1. 实验材料（1）乙脑病毒抗原、抗体及核酸检测试剂盒；（2）乙脑病毒分离培养用的细胞株；（3）乙脑病毒感染患者血清、脑脊液样本；（4）乙脑病毒感染动物模型。

2. 实验方法（1）乙脑病毒抗原检测采用间接免疫荧光试验（IFA）检测乙脑病毒抗原。

将病毒抗原与荧光素标记的抗体结合，观察荧光颗粒的出现情况，判断乙脑病毒抗原的存在。

（2）乙脑病毒抗体检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测乙脑病毒抗体。

将乙脑病毒抗原包被于微孔板，加入待测血清，通过酶标记的二抗检测抗体，计算抗体滴度。

（3）乙脑病毒核酸检测采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测乙脑病毒核酸。

提取病毒核酸，通过RT-qPCR扩增病毒基因片段，定量检测病毒核酸含量。

（4）乙脑病毒分离培养将乙脑病毒感染患者血清、脑脊液样本接种于乙脑病毒敏感细胞株，观察病毒分离培养结果。

三、实验结果1. 乙脑病毒抗原检测在乙脑病毒感染患者血清、脑脊液中，均检测到乙脑病毒抗原。

2. 乙脑病毒抗体检测在乙脑病毒感染患者血清中，ELISA法检测到乙脑病毒抗体，抗体滴度较高。

3. 乙脑病毒核酸检测在乙脑病毒感染患者血清、脑脊液中，RT-qPCR法检测到乙脑病毒核酸，核酸含量较高。

4. 乙脑病毒分离培养将乙脑病毒感染患者血清、脑脊液样本接种于乙脑病毒敏感细胞株，观察到病毒分离培养阳性结果。

四、讨论本实验通过多种实验室检测方法，对乙脑进行了诊断。

结果显示，乙脑病毒抗原、抗体及核酸均呈阳性，证实了乙脑的诊断。

1. 乙脑病毒抗原检测是乙脑诊断的重要依据。

本实验中，乙脑病毒抗原检测呈阳性，说明患者体内存在乙脑病毒。

1. 了解乙脑病毒的生物学特性及其传播途径。

2. 掌握乙脑病毒检测的基本原理和方法。

3. 提高对乙脑病毒检测技术的操作技能。

二、实验原理乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种黄病毒科病毒，主要通过蚊子叮咬传播，引起人类和动物发生脑炎。

乙脑病毒检测主要包括病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等。

本实验采用RT-PCR技术检测乙脑病毒核酸。

三、实验材料1. 乙脑病毒核酸模板：阳性对照、阴性对照、待测样本。

2. RT-PCR试剂盒：包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒。

3. 实验仪器：PCR仪、离心机、凝胶成像系统、电子天平等。

四、实验方法1. 样本处理（1）取待测样本，加入RNA提取试剂盒中的裂解液，充分振荡，使病毒核酸充分释放。

（2）按照试剂盒说明书进行RNA提取。

（3）将提取的RNA进行逆转录，合成cDNA。

2. RT-PCR反应（1）配制PCR反应体系，加入引物、模板、dNTPs、Taq酶等。

（2）按照PCR试剂盒说明书进行RT-PCR反应。

3. 结果分析（1）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。

（2）以阳性对照和阴性对照为标准，判断待测样本是否含有乙脑病毒核酸。

1. 阳性对照：在预期位置出现特异性扩增条带。

2. 阴性对照：无特异性扩增条带。

3. 待测样本：在预期位置出现特异性扩增条带。

六、实验讨论1. 本实验采用RT-PCR技术检测乙脑病毒核酸，具有较高的灵敏度和特异性。

2. 实验过程中，应注意以下几点：（1）严格操作，避免污染。

（2）提取RNA时，确保充分裂解病毒。

（3）逆转录反应时，严格控制温度和时间。

（4）PCR反应时，优化反应体系，提高扩增效率。

3. 乙脑病毒检测在流行病学调查、临床诊断和疫苗研发等方面具有重要意义。

七、结论本实验成功检测了乙脑病毒核酸，表明RT-PCR技术是一种高效、灵敏的乙脑病毒检测方法。

在实际应用中，应结合多种检测技术，提高乙脑病毒检测的准确性和可靠性。

宠物犬自然感染乙型脑炎病毒中和抗体动态变化的研究沈强;刘学辉;常维山;马志永;史子学;魏建超;邵东华;李蓓蓓;蒋春英;赵凡凡;张帆;王水明【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2013(29)11【摘要】目的以宠物犬为研究对象,监测在自然感染条件下其体内乙型脑炎病毒(JEV)中和抗体随流行季节的变化规律,进而评估JEV感染人的风险性.方法按月采集不同年龄的宠物犬血液,分离血清,用微量细胞中和试验检测血清JEV中和抗体.结果共得到宠物犬血清253份,中和抗体阳性率达到28.1%.不同季节间犬JEV中和抗体阳性率差异显著,JEV流行季节(6-9月)之前(3-5月)和之后(10-12月)的3个月中和抗体阳性率分别为16.3%和43.4%,差异有统计学意义(χ2=14.432,P<0.01).小于1岁与大于1岁的宠物犬中和抗体阳性率分别为24.1%和39.0%,二者差异显著(χ2=5.633,P<0.05).而犬的性别间中和抗体阳性率显著无统计学意义(χ2=1.860,P>0.05).结论在JE流行季节宠物犬受到JEV自然感染的机率较高,可作为哨兵动物来评估JEV感染人的风险.【总页数】5页(P1050-1054)【作者】沈强;刘学辉;常维山;马志永;史子学;魏建超;邵东华;李蓓蓓;蒋春英;赵凡凡;张帆;王水明【作者单位】山东农业大学动物医学院,泰安,271000;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;南京出入境检验检疫局,南京,211106;山东农业大学动物医学院,泰安,271000;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海,2004241;南京出入境检验检疫局,南京,211106;南京出入境检验检疫局,南京,211106【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.云南省边境地区蚊虫自然感染乙型脑炎病毒的研究 [J], 张海林;米竹青;张云智;龚正达;自登云;施华芳;龚鹤琴;杨卫红;李兆祥;侯宗柳;杨兰萍;章域震;黄文丽2.云南省西双版纳州蚊虫自然感染乙型脑炎病毒的研究 [J], 张海林;施华芳;米竹青;龚正达;自登云;张云智;杨卫红;李兆祥3.云南三带喙库蚊分布特点及自然感染乙型脑炎病毒的调查 [J], 张海林;自登云;施华芳;米竹青;龚正达;张云智;冯锡光;侯宗柳;李兆祥;杨兰萍4.大连市蚊媒调查及淡色库蚊、三带喙库蚊自然感染流行性乙型脑炎病毒研究 [J], 姜义霖;宋锋林;李宁;杜海方;周宝森5.蝙蝠自然感染乙型脑炎病毒的研究 [J], 张海林;施华芳;米竹青;龚正达;国正鸣;李兆祥;自登云;甲利;刀红兵;李新年;戴祥明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种检测乙型脑炎病毒抗体阻断ELISA的建立及其初步应用江雅;牛季琛;倪慧;韦冬妹;周国栋;曹瑞兵【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2018(049)009【摘要】流行性乙型脑炎是由日本脑炎病毒(JEV)引起的蚊媒传播人畜共患传染病,严重危害人类和猪、马等动物的健康.为建立检测多种动物血清中JEV抗体的ELISA,应用重组囊膜蛋白和辣根过氧化物酶标记的JEV单克隆抗体建立了检测JEV 抗体的阻断ELISA.结果显示:通过对100份JEV抗体阴性猪血清的检测结果进行统计学分析,确定阻断ELISA的判定标准:阻断率(PI)≥34％时判定为阳性,PI≤25％时判定为阴性,25 ％＜PI＜34％时判定为可疑.该阻断ELISA与其他常见猪病毒病抗体阳性血清无交叉反应;批内和批间重复试验的变异系数均小于5％;与商品化ELISA试剂盒的对比检测表明,敏感性为98.5％、特异性为94.3％,两者的符合率为97.2％.应用该阻断ELISA对临床收集的猪、牛和羊共515份血清样品进行检测,JEV抗体阳性检出率分别为74.5％、13.3％和9.2％,抽样的血清中和试验结果与阻断ELISA检测结果的符合率为100％(9/9).本研究成功建立了可适用于猪、牛和羊临床血清JEV抗体检测的阻断ELISA方法.【总页数】8页(P1961-1968)【作者】江雅;牛季琛;倪慧;韦冬妹;周国栋;曹瑞兵【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京210095;南京农业大学动物医学院,南京210095;南京农业大学动物医学院,南京210095;南京农业大学动物医学院,南京210095;南京农业大学动物医学院,南京210095;南京农业大学动物医学院,南京210095【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.日本乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用 [J], 李建;谢红玲;廖园园;秦红刚;刘洁;朱薇;漆世华;韩兴;徐松;舒银辉2.用抗传染性法氏囊病毒单克隆抗体建立夹心阻断ELISA检测鸡血清抗体及初步应用 [J], 朱红3.检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用 [J], 沈婷;周斌;陈溥言4.塞内卡病毒A VP2蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用 [J], 孙培培;朱慧欣;延君芳;刘文文;姜平;白娟5.猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用 [J], 黄立平;刘长明;危艳武;陆月华;郭龙军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。