血清-病毒中和试验的标准操作规程

标准操作规程（SOP）——一、目的微量中和试验是一种敏感性高、特异性强的血清学方法，用于测定血清中的病毒特异性中和抗体水平。

中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程，进行流感/禽流感微量中和抗体检测实验，以确保实验的准确性。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感微量中和抗体检测。

三、责任进行流感/禽流感微量中和抗体检测的技术人员需严格按照规定进行操作。

四、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。

其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。

操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。

（二）材料1．中和反应实验材料（1）病毒：一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。

进行中和试验之前，需先进行病毒滴度（TCID50）的滴定。

具体步骤如下，1）病毒的稀释：可采取对数或者半对数稀释的方法。

以下介绍半对数稀释法。

取1管冻存病毒尿囊液，用病毒培养液进行1:100稀释。

第一列4个孔每孔加入146μL 1:100稀释过的病毒液，其它各列每孔加入100 μL 病毒培养液。

然后用多道加样器从第一孔吸46μL 至第二孔，做系列半对数稀释，使之成为10－2、10－2.5、10－3、10－3.5……10－7。

每孔含有100μL 病毒液。

2）每孔加入100μL MDCK 细胞悬液（1.5×104细胞/孔），37℃，5%CO 2培养箱孵育18～22h 。

每一滴度作平行4孔。

3）细胞固定、ELISA 操作如下述。

4）OD 值 〉2倍MDCK 细胞对照OD 值判定为阳性5）病毒滴度计算见组织细胞半数感染量滴定SOP 。

（2）血清样品：包括待检血清、阳性及阴性血清对照。

如果待检血清有可能需要多次检测，则需将待检血清进行小量分装，-20℃至-70℃保存均可，避免多次反复冻融。

中和试验方法操作规程1.目的：建立中合实验法，统一操作标准，确保产品质量。

2.适用范围：公司生物制品效价测定的中合实验。

3.责任：质检人员有按此程序进行操作的责任，质量管理部经理有检查监督的责任。

4.程序：4.1：实验前准备①、9-10日龄的SPF鸡胚、病毒。

②、样品稀释管、病毒稀释管、打孔器、镊子、5ml吸头、1ml、200ul吸头各一盒、废弃物缸、烧杯，以上物品均需灭菌处理③、照蛋器、电炉、旋涡混合器、5ml微量移液器、1ml微量移液器、200ul微量移液器、记号笔、酒精棉球、碘棉、打火机、蜡、玻璃棒、无菌手套④、实验开始前记得要使房间温度达到30摄氏度左右，房间要紫外照射30min，生物安全柜紫外照射30min准备要用的检测用品同步放在生物安全柜里紫外照射。

4.2：稀释①、将样品用生理盐水2倍系列稀释，使之成1:2;1:4;1:8;1:1;,1:32;1:64;1:128;1:256；1:512；1:1024......。

②、病毒的稀释：将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50.。

例如：病毒ELD50=10-8.375/0.1ml,将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50的稀释倍数=108.375/200=1.2*106。

即将病毒稀释 1.2*106倍即为200ELD50/0.1ml。

③、准备七根试管（或EP管），编号1-7，在1号管中加入0.2ml 灭菌生理盐水，2-7号管中各加入9ml 灭菌生理盐水.再将ELD50=108.375/0.1ml 的病毒取1ml加入1号管中震荡混匀，再从1号管中取1ml加入2号管中震荡混匀,依次10倍系列稀释至第7管。

(依据最后接种量和接种鸡胚数计算出中和抗体用病毒的量,7号管可以多稀释几支备用。

)4.3：中和:将稀释成每单位剂量含200 ELD50的病毒与等量的2倍系列稀释的待检样品混合,37度中和1小时,准备接种鸡胚。

4.4：在中和的一个小时里准备工作:①、照蛋,弃掉发育不好的和活力不强的鸡胚,②、在血管较少的部位画出气室,③、然后消毒鸡胚(先用碘棉酒毒再用酒精格脱碘),④、随机分组,、编号:一个样品稀释度为一组,每个稀释度3~6枚鸡胚,进行编号。

中和试验一．定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。

但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。

而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。

用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。

用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。

在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。

(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3 ……10-9，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。

表2-24LD50的计算（接种剂量为0.03ml）病毒稀释度接种鼠数活鼠数死鼠数积累总计死亡比死亡率(%)10-4 5 0 5 0 15 15/15 10010-5 5 0 5 0 10 10/10 10010-6 5 1 4 1 5 5/6 8310-7 5 4 1 5 1 1/6 1710-8 5 5 0 10 0 0/10 010-9 5 5 0 15 0 0/15 0LD50的计算：按Reed和Muench氏法计算。

高于50%的死亡分数-50%83%-50%距离比例= ────────────────────= ──────= 0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数83%－17%LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。

血清中和抗体检测流程英文回答：The process of detecting serum neutralizing antibodies involves several steps to ensure accurate and reliable results.First, blood samples are collected from individuals and the serum is separated from the blood cells. The serum is then treated to inactivate any potential infectious agents that may be present in the sample.Next, the serum is diluted to a specific concentration and mixed with a standardized amount of the virus or pathogen that the antibodies are being tested against. This mixture is then incubated for a period of time to allow the antibodies in the serum to neutralize the virus.After the incubation period, the mixture is added to a cell culture or other system that supports viralreplication. If the antibodies in the serum are able to neutralize the virus, there will be a reduction in viral replication compared to a control sample without serum.The final step involves measuring the level of viral replication in the presence of serum and comparing it to the control sample. This can be done using various techniques such as quantitative PCR or plaque assays.The results of the serum neutralizing antibody test can provide valuable information about an individual's immune response to a specific virus or pathogen. This information is important for understanding immunity to infectious diseases and for developing effective vaccines and treatments.中文回答：血清中和抗体检测流程涉及多个步骤，以确保结果准确可靠。

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RSV特异性中和抗体滴度检测一、实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。

（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。

）二、实验分类：1. 固定血清--稀释病毒中和试验2. 固定病毒—稀释血清中和试验3. 简单定性中和试验4. 空斑减少法三、实验步骤：1.提前设定56 ℃水浴锅，将分装好的待测血清于56 ℃灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。

2.将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37℃预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。

3.实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210µl，再加相应的血清30µl），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75µl的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75µl，用排枪以两倍梯度稀释血清。

（注意：最终到256倍时吸出的多余的75µl血清并弃掉。

）4.实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25 µl（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104 TCID50病毒混匀，4℃孵育2 h。

5.在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37℃的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。

RSV 特异性中和抗体滴度检测一、实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。

（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2 倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。

）二、实验分类：1. 固定血清--稀释病毒中和试验2. 固定病毒—稀释血清中和试验3. 简单定性中和试验4. 空斑减少法三、实验步骤：1. 提前设定56 C水浴锅，将分装好的待测血清于56 C灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。

2. 将加过双抗的培养基DMEM/F-12 （用于Hep-2 细胞；Vero 细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37C预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。

3•实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210卩」再加相应的血清30^）1,拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1）,最后向每孔中加入75卩的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75门用排枪以两倍梯度稀释血清。

（注意：最终到256倍时吸出的多余的75卩血清并弃掉。

）4•实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25卩1（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104TCID50病毒混匀，4C孵育2 h。

5. 在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml 无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入 2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37C的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml 轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml 离心管中等待细胞计数。

中和试验步骤1、测定病毒TCID100µl50/2、制备细胞悬液，使细胞浓度约为1×105个/mL，加到96孔细胞培养板中，每孔100µl。

置37℃CO2培养箱中，直至细胞长至单层。

3、血清灭活：将待检测的血清放到56℃水浴30min（此时血清中的病原菌都已被灭活）。

4、100TCID50/50µl病毒液或者200TCID50/25µl病毒液的制备，这两者是等价的。

100TCID50/50µl病毒液制备方法：计算已测定了TCID50/100µl 的病毒原液稀释至100TCID50/50µl的稀释倍数:lg100TCID50/50µl=-log100-log(100/50)=-2.30103得100TCID50/50µl=10-2.30103，假设病毒TCID50/100µl=10-6.3，则稀释倍数=(100TCID50/50µl)÷(TCID50/100µl)=106.3÷102.30103≈9976倍。

5、取一块新的96孔板，1-10列每孔加50µl待检血清原液，再用8道孔排枪加每孔100TCID50/50µl病毒液50µl，稍微吹打使血清与病毒液混均。

11列先每孔加50µl维持液，再于11列的第一孔加50µl 标准阳性血清，将标准阳性血清往下作1:2、1:22至1:28倍稀释。

12列第1孔加标准阴性血清原液50µl，再加100TCID50/50µl病毒液50µl。

用维持液将100TCID50/50µl的病毒液作4次连续10倍稀释，稀释成10TCID50/50µl、1TCID50/50µl、0.1TCID50/50µl,依次加到第12列的3到6孔，每孔加50µl，再每孔加50µl维持液。

1.目的建立血清BVDV中和抗体检验操作规程，以确保抗体水平检测效果。

2.适用范围初制、精制血清的BVDV中和抗体检验操作。

3.职责3.1.质量管理部：负责本规程的起草。

3.2. QC：负责本程序的操作。

4.3. 总经理：负责本规程的审批。

5.定义无6.引用标准《中华人民共和国兽药典》2010版7.材料及设备8. 1 试剂9. 1.1. 标准毒株OregOnC14V9.1.2, 标准阳性血清、标准阴性血清6.1.3. 犊牛原代•肾细胞、睾丸细胞和牛肾细胞系（MBDK）细胞。

6∙2 实验器材9.2.1. 微量细胞培养板（简称微量板）96孔平底板。

6・2.2,加样器：100μ1单通道和多通道的可调加样器。

9.2.3.相应的吸尖6∙2.4. 培养基6.2.5. 稀释液及营养液（DMEM或MEM），pH7.0〜7.2,每毫升加100μg链霉素和IOOIU青霉素,按说明书配制。

6. 2.6. 生长液：营养液加10%犊牛血清。

7. 2.7. 维持液：营养液加2%〜5%犊牛血清。

8. 2.8. 细胞消化液：EDTA-胰酶9. 2.9. 被检血清：常规分离血清，56℃灭活30位11。

10.流程图无11.内容8.1 定量试验8.1.1. 血清稀释8.1.1.1. 用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液50μ1o8.1.1.2. 用单通道加样器取50μ1灭活的被检血清加于微量板的第一排孔中，每份样品加4个孔。

8.1.1.3, 用多通道加样器（调至50H1）从第一排孔开始作连续倍比稀释，直至最后一个孔，并从最后孔中弃去50U1稀释物。

8.1.2.加病毒/50μ1的工作液。

8.1.2.1. 用稀释液将标准毒株0regonC24V稀释成含100TCID508.1.2.2. 用多通道加样器从第二排孔开始每孔加病毒工作液50μ1,第一排孔中加50μ1稀释液作为被检血清对照。

8.1.3.将微量板盖严，置于37C 5%二氧化碳培养箱中中和2小时。