实验四 小鼠精子畸形试验共16页文档

＊　安徽省教育委员会资助课题作者单位:233003　蚌埠医学院卫生学教研室小鼠精子畸形试验方法的改进＊周纯先　肖　棣　王帮霞　王允滋摘要　目的:改进检测小鼠精子畸形的试验方法。

方法:采用改进的小鼠精子畸形试验方法进行观察,并与有关试验方法作对比研究。

结果:两种不同量0.9%生理盐水制备的小鼠精子玻片镜检显示,环磷酰胺阳性组和生理盐水对照组,其观察结果均以用1ml 0.9%生理盐水作稀释液制备的玻片镜检满意,符合小鼠精子畸形分析的试验要求。

结论:本法具有操作简便、镜检满意和结果可靠等优点。

关键词　精子计数　小鼠中国图书资料分类法分类号　R 321.1Improvement in method of sperm aberration test in miceZhou Chunxian ,Xiao Di ,Wang Bangxia ,Wang Yunzi(Department of Hygiology ,Bengbu Medical College ,Anhui 233003)A bstract Objective :To improve the method of sperm aberration test in mice .Methods :The im proved method for sperm aberration test was used in mice to compare w ith o ther methods .Results :Tests taken from cyclophosphamide mice and norm al saline treated mice w ere used to make sperm suspension in 2different volume (1and 3ml )of 0.9%saline for smear examination of abno rmal sperm under microscope .The result show ed that sperm suspended in 1m l saline w as satisfactory .Conclusions :This method has m any adventages ;it is easy to perfo rm ,the amount of sperm obtained is satisfactory fo r ex amination and the results are reliable .Key words sperm count ;mice 精子畸形试验常用于观察精子头部和尾部的形态异常,是研究外来化学毒物诱发人或动物精细胞突变和判断有无生殖毒性作用的常用方法之一。

毒理学实验五小鼠精子畸形实验一、实验目的1、学习观察小鼠精子畸形的实验方法。

2、检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性。

二、实验原理小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。

在正常情况下，人与其它哺乳动物的精液中也有少量畸形精子，毒物影响下，数量大大提高。

三、试剂材料1、健康成年雄性小鼠，体重25 g ~30g2、器材剪子、镊子、玻璃小平皿、滴管、载玻片、擦镜纸、染色缸、显微镜3、试剂生理盐水、甲醇、2％伊红水溶液、受试物及阳性对照物环磷酰胺四、实验内容1、解剖小鼠、摘取附睾、涂片、固定。

2、镜下观察精子形态，记录畸形精子。

3、计算精子畸形率。

4、结果分析与评价。

五、操作步骤1、染毒：染毒5天，途径（一般经口）2、处死：35天后颈椎脱臼处死3、取材：附睾4、涂片：将附睾所有内容物直接涂片（一滴生理盐水）5、晾干：6、固定：甲醇固定5分钟7、冲洗和干燥8、镜检：低倍镜----油镜，镜检1000个精子，记录座标。

阴性对照组精子畸变率一般为1-3%精子畸形主要表现：(1)头部：无钩、香蕉形、胖头、无定形、双头(2)尾部：卷尾、双尾六、实验设计剂量和分组方法:受试物至少设3个剂量组，同时设阳性和阴性对照组。

最高剂量组应能使部分动物死亡，然后以高剂量组的1/2～1/4递减作为中、低剂量组。

阳性对照组给予环磷酰胺(20mg/kgBW～40mg/kgBW)，腹腔注射，连续5d，每天一次。

阴性对照组给予等体积的溶剂。

七、实验结果及分析1、正常小鼠精子涂片：由于是正常小鼠的精子涂片，因其畸形精子比例较低，没有观察到畸形精子，观察到一些正常精子，但由于没有进行固定染色，所以不是非常清晰。

在观察图片过程中，看到了一些条纹状的结构，阻碍了精子的观察，考虑可能是浓度太浓或者除精子外的其他组织被涂在载玻片上所致。

2、通过小鼠染毒的畸形精子样片，在镜下观察到了正常精子及畸形精子。

DB22/T 396.8—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第8部分：小鼠精子畸形试验警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。

本标准并未指出所有可能得安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施。

并保证符合国家有关法规规定的条件。

1 范围本标准规定了保健用品毒理学精子畸形评价方法。

本标准适用于保健用品毒理学精子畸形检验方法。

2 精子畸形试验2.1 实验动物健康成年雄性小鼠，周龄为7 周～12 周，体重25 g～35 g，一般每组至少5 只。

试验前在实验动物房至少适应3 天～5 天。

2.2 仪器和试剂2.2.1 仪器2.2.1.1 解剖器械。

2.2.1.2 电子天平。

2.2.1.3 离心机。

2.2.1.4 冰箱。

2.2.2 试剂2.2.2.1 0.1 %秋水仙素置于棕色瓶中，冰箱保存。

2.2.2.2 60 %冰乙酸取60 ml冰乙酸(分析纯)，加蒸馏水至100 ml。

2.2.2.3 1 %柠檬酸三钠取1 g柠檬酸三钠(分析纯)，加蒸馏水至100 ml。

2.2.2.4 固定液甲醇：冰乙酸=3:1，现用现配。

2.2.2.5 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)磷酸氢二钠溶液(1/15 mol/L):磷酸氢二钠（Na2HPO4 ,分析纯）9.47 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。

1DB22/T 396.8—20172 磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)：磷酸氢二钾溶液（KH2PO4 , 分析纯）9.07 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。

取磷酸二氢钠 (1/15 mol/L)：80 ml与磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)20 ml 混合，调pH至7.4。

2.2.2.6 Giemsa 染液称取Giemsa 染液3.8 g，加入375 ml甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后再加入125 ml甘油。

置于37 ℃恒温箱保温48 h振摇数次。

过滤两周后用。

2.2.2.7 Giemsa 应用液取一份 Giemsa 染液与 9 份 磷酸盐缓冲液混合而成，现用现配。

一、实验背景近年来，随着环境污染、食品安全等因素的影响，动物畸形现象日益严重。

为研究环境因素对动物畸形的影响，本实验以小鼠为实验动物，通过观察小鼠的畸形情况，探讨环境因素对动物畸形的影响。

二、实验目的1. 了解小鼠畸形的特征及其影响因素；2. 分析环境因素对小鼠畸形的影响；3. 为预防和控制动物畸形提供理论依据。

三、实验材料与方法1. 实验动物：昆明小鼠，雌雄各50只，体重20-25g。

2. 实验分组：将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组、A组、B组、C组和D组。

3. 实验处理：对照组不做任何处理；A组给予高浓度农药；B组给予高浓度重金属；C组给予高浓度有机溶剂；D组给予高浓度染料。

4. 实验观察指标：观察小鼠的畸形情况，包括外观畸形、内脏畸形等。

5. 数据分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，比较各组小鼠畸形率的差异。

四、实验结果1. 小鼠畸形特征实验结果显示，各组小鼠均存在不同程度的畸形现象。

对照组小鼠畸形率为10%，A组为20%，B组为25%，C组为30%，D组为35%。

其中，外观畸形以耳部、眼部、尾部、四肢等部位畸形为主；内脏畸形以心脏、肝脏、肾脏等器官畸形为主。

2. 环境因素对小鼠畸形的影响经统计分析，与对照组相比，A组、B组、C组和D组小鼠畸形率均显著升高（P<0.05）。

表明农药、重金属、有机溶剂和染料等环境因素对小鼠畸形具有显著影响。

五、实验讨论1. 本实验结果表明，农药、重金属、有机溶剂和染料等环境因素对小鼠畸形具有显著影响。

这与相关研究结果一致，表明环境污染是导致动物畸形的重要原因。

2. 实验中，各组小鼠畸形率随环境因素浓度的增加而升高，说明环境因素对小鼠畸形的影响程度与其浓度密切相关。

3. 本实验中，小鼠畸形以外观畸形和内脏畸形为主。

这与相关研究结果一致，表明环境污染对动物的影响不仅表现在外观上，还可能对动物的器官功能造成损害。

六、结论1. 环境污染是导致动物畸形的重要原因；2. 农药、重金属、有机溶剂和染料等环境因素对小鼠畸形具有显著影响；3. 为预防和控制动物畸形，应加强环境保护，降低环境污染。

歧特生冲剂的小鼠精子畸形试验摘要：目的：对三株牌歧特生冲剂进行小鼠精子畸形试验，以测定其是否具有遗传毒性。

方法：参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的试验方法。

结果：其一，样品剂量组与隐性对照组相比，无统计学意义，判为阴性；其二，样品剂量组与阴性对照组相比，精子畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系，判为阳性；其三，样品剂量组与阴性对照组相比，有统计学意义，但无剂量反应关系，重复试验，结果能重复者判为阳性，否则为阴性。

结论：本试验条件下，受试样品剂量组的精子畸形率与阴性对照组（Veh）比较无显著性差异（P>0.05），无剂量反应关系，表明三株牌歧特生冲剂对小鼠精子的精子畸形率未产生明显影响。

关键词：三株牌歧特生冲剂、小鼠精子畸形试验三株牌歧特生冲剂，由三株福尔制药有限公司生产，其主要作用在于调节肠道菌群平衡，从而改善肠道功能的作用。

小鼠精子畸形受基因等因素的控制，具有很强的遗传特性，但同时，受外部环境的影响，会产生一些形态上的变化，我们称之为精子畸形。

小鼠精子畸形试验可检测外部因子对精子的生成和发育的影响，是遗传毒理学评价的主要指标之一[1]。

三株牌歧特生冲剂，6 g/袋，白色粉末状固体，本品易溶于水，批号为160403，常温保存；功效成分为水苏糖，每袋不少于3 g；人体推荐食用方法及食用量为口服，每日1～2次，每次1袋。

溶媒为灭菌蒸馏水。

1实验动物及饲养环境小鼠，品系：KM，雄性，体重30~35 g，25只，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，经检疫观察4 d后使用。

饲养环境：屏障系统，5只/笼（同性别、同剂量组），喂食SPF鼠料，自由饮水。

温度24.7～26.0 ℃，相对湿度50～60 %，人工光照，明暗12 h/天。

SPF大小鼠生长维持饲料，来源：北京华阜康生物科技股份有限公司。

实验动物饮用水为中心提供纯化水，高压蒸汽灭菌。

饲养笼种类：PP聚丙烯鼠盒，底铺高压蒸汽灭菌的玉米芯垫料。

体外受精（IVF）实验步骤
1.实验前日准备体外受精用培养皿
精子游离以及定量用培养皿：35mm 培养皿中加入2个200μL TYH培养基液滴
*先加入50μL TYH培养基液滴，覆盖上矿物油后再加入150μL TYH 培养基液滴
体外受精用培养皿：35mm培养皿中加入两个50μL TYH培养基液滴以及两个200μL液滴
2.实验当日，处死雄小鼠一只，将附睾中的精子放入准备好的精子
游离用培养皿。

*用镊子将精子取出后直接放入一个盛有200μL TYH的液滴中。

3.让精子游离获能。

*在游离一个半小时后，进行精子浓度统计。

将5μL 精子悬浊液和45μL 3% NaCl混合，取适量在血球计数器中测定浓度。

为了保证此时的浓度维持在2×106个/毫升，将相邻的一个200μL TYH液滴中，取出相应的培养基，加入等量的精子悬液。

4.让稀释以后的精子继续游离，直至2个小时。

5.处死经过超排处理的雌鼠，分离卵管，放入装有矿物油的培养皿。

6. 用镊子取出卵丘细胞团，直接放入体外受精用培养皿中的200μL TYH培养基中。

*每个液滴内放2-3只小鼠的卵丘细胞团。

7. 用微量注射枪吸取10μL稀释后的精子悬液放入卵丘细胞团的TYH培养基中。

*此时精子的最终浓度约105个/毫升.
8. 体外受精持续4-6个小时。

9. 用吹管将完成体外受精的卵子分离，在50μL的TYH液滴中吹打洗净。

10. 移入约半小时前准备好的CZB液滴中，镜检，出去未受精卵以及只有一个前核的孤雌发育胚胎，统计体外受精百分比。

药物毒理学实验指导南方医科大学药学院实验中心二0一0年八月目录实验一、药物急性毒性实验（LD50测定）实验二、急性肺损伤实验实验三、药物免疫毒性试验实验四、小鼠骨髓细胞微核试验实验五、小鼠精子畸形实验实验六、药物生殖毒性实验实验一 急性毒性试验［盐酸二甲弗林（回苏灵）LD 50测定］一、实验目的化学物急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。

本实验的目的是学习急性毒性试验的实验设计、实验原理和实验操作方法。

二、基本原理选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD 50计算的设计原料则将动物分成数个染毒组。

一次或24h 内多次给予受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计算半数致死量（LD 50）。

据此分析受试物毒性反应与剂量的关系，并根据LD 50值对化学物进行毒性分级。

三、实验材料1、器材 1ml 注射器、烧杯、电子天平、苦味酸、镊子、剪刀、酒精棉球等。

2、药品 0.4％回苏灵注射液（经预试验后按比例稀释）。

3、动物 健康成年小白鼠若干只，体重18-22g ，雌雄各半。

四、实验方法 1、预试验（1）探索剂量范围：先找出100%与0%的致死量为实验的上下限剂量，即Dmax 和Dmin 。

取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax ；如降低一剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax 。

同法找出Dmin 。

（2）确定合适的剂量分组方案：组数（n ）以5-8组为宜，根据下面公式计算组间剂量公比r 。

r=1/1min max/ n D D各组剂量分别Dmax 、(Dmax) r 、(Dmax)r2、(Dmax)r3……。

2、正式试验（1）动物的称重、编号和分组： 每组10只动物（雌雄各半），随机分组和用苦味酸编号。

精子畸形率检测一、实验目的：精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法。

通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。

1.熟悉精子畸形的概念及类型、精子畸形试验的实验设计、试验检测的遗传学终点。

2.学习和掌握小鼠精子畸形试验的基本方法步骤，正常精子及畸形精子的镜下观察。

3.了解精子畸形试验数据整理、分析方法及结果的评价。

二、实验原理：1.小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。

2.精子的畸形主要是指形态的异常，是决定精子形成的基因发生突变的结果。

因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。

三、实验器材及试剂：眼科剪、眼科镊、小平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管、载玻片、玻璃染缸1%伊红染液、9%生理盐水四、实验步骤：1.制片颈椎脱臼处死小鼠，取出双侧附睾，将附睾放入1ml磷酸盐缓冲液或生理盐水中。

用眼科剪将附睾纵向剪1~2下，静止3~5min，轻轻摇动。

吸取此精子悬液滴于清洁载玻片一端，均匀推片，待玻片晾干后用甲/乙醇固定5min以上，自然晾干。

用1%~2%伊红染色15min，用水轻冲，干燥。

2.阅片在低倍镜下找到背景清晰、精子重叠较少的区域，然后用油镜计数。

每只小鼠为一观察单位，计数1000条完整的精子中畸形精子数，计算各组小鼠精子畸变率。

其中有头无尾（轮廓不清）、头部与其他精子或碎片重叠及人为剪碎的精子均不计算。

精子畸形主要表现在头部，其次为尾部，可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。

异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备复查。

并分别记录异常类型，以便统计精子畸形率及精子类型的构成比。

判断双头、双尾畸形时，要注意与两条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。

五、注意事项：判断双头、双尾畸形时，要注意与两条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。

小鼠发育生物学实验内容实验一：小鼠卵母细胞和精子的形态观察一、实验目的：掌握胚胎体外操作工具的制备、小鼠超数排卵方法以及小鼠精子和不同发育阶段观卵母细胞的收集方法，观察精子结构和运动状态，评估精子活力，观察卵母细胞结构，了解体外授精操作过程。

二、操作过程：1 胚胎体外操作工具制备在酒精喷灯上将玻璃管拉成直径1mm的细管，连上乳胶管即可。

2 小鼠的抓去与保定3 收集精子断颈处死公鼠，打开腹腔，找到睾丸和附睾，剪取附睾尾，剪碎，置1.5ml离心管底部，加0.5ml 生理盐水，置37度水浴锅20分钟，用吸管从离心管上部取50微升液体，置细胞计数板，观察精子结构、密度和活力。

精子活力计算公式：精子活力＝视野中直线运动的精子数/视野中总精子数4 收集卵母细胞成熟卵母细胞的收集：母鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（每只10单位），48小时后再注射人类绒毛膜促性腺HCG（每只10单位），18小时后断颈处死母鼠，打开腹腔，剪下输卵管，用镊子刺破输卵管壶腹部，释放卵母细胞，用透明质酸酶溶液（10毫克/毫升生理盐水）处理卵母细胞以除去颗粒细胞，在实体显微镜下观察卵母细胞的结构。

未成熟卵母细胞的收集：断颈处死性成熟前母鼠，打开腹腔，剪取卵巢，加入1毫升盐水，用刀片或镊子捣碎卵巢，寻找生发泡状态的卵母细胞，观察卵母细胞结构。

5 体外授精将卵母细胞与精子共培养（微滴培养法）（演示）三、实验结果各种精子和卵子的形态绘图；精子活力；精子密度四、实验收获与体会，存在问题和改进意见。

实验二：小鼠早期不同发育阶段胚胎的收集、观察以及胚胎移植一、实验目的：掌握小鼠附植前胚胎收集方法，观察不同发育阶段小鼠胚胎的结构，认识小鼠早期胚胎形态学，并了解体内发育阶段与所处生殖器官位置的关系，了解小鼠胚胎移植的基本原理和操作过程。

二、操作过程：1 小鼠超数排卵程序中午12时腹腔注射PMSG，48小时后腹腔注射HCG并与公鼠合笼交配，次日清晨检查阴道栓，如果发现阴道栓则妊娠0.5天。

精子检测报告怎么看？如何看精液分析报告单？男人精子是否有问题需要做精液检查，那么检查结果如何知道是否有问题呢？精子检测报告怎么看？如何看精液分析报告单？下文为大家讲解精子检查报告的一些正常值和异常值。

精液量：正常数值范围是2～6毫升精液量是指每次射精排出的数量。

正常的精液量是2～6毫升，最低需要1.5～2毫升，如果低于这个数值，就说明精液量有点少了，甚至可能是少精症。

当然，精液量也并不是越多越好，如果精液量太多，需要排除是不是病态的“多”。

精子密度：每毫升1500万算正常精子密度是指单位体积内精子的数量。

现在，精子密度能达到每毫升1500万就已经算是正常了。

然而，在30年前，精子密度要求达到每毫升6000万～2亿。

“可以说，现在男性的生殖能力已经大大退化。

这种退化跟现在的环境以及人们的生活方式不无关系。

比如现在人们开车的多了，走路的少了，长时间坐着的人多了，运动少了。

”精子密度少于1500万/毫升，属于少精症，精子进入子宫腔及输卵管的机会就会减少，从而导致受孕能力降低；但如果超过2亿/毫升，则属于多精症，精子活动力会受到影响，同样也会影响精子受孕的能力。

因此，精子密度过高、过低甚至无精，都是男性不育因素。

精子活动力：直线前向运动精子要≥32% 精子的活动力一般分四级。

0级指无活动的精子；1级指在原地活动的精子；2级为缓慢向前曲线游动的精子；3级为直线向前游动的精子；4级为快速直线向前游动的精子。

一般情况下，3级以上的精子，才有可能使卵子受精。

要成功受孕，一般要求3级精子加上4级精子的比例要大于32%。

精子成活率和畸形率：分别为58%以上和96%以下精子的成活率也很重要。

成活率通常是指在射精后一小时内，具有活动能力的精子比例。

正常的情况下，精子的成活率要在58%以上。

同样，精子的畸形率也影响着精子的受孕能力。

精子畸形率在92%以下是一个比较理想的指标。

“如果能够在96%以下也算是及格了。

”事实上，精子成活率和畸形率的标准也已经降低了。

十三、精子畸形试验Sperm Malformation Test1 范围本规范规定了动物精子畸形试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。

2 引用标准GB 14924 试验动物与饲料标准GB 15193·94 食品安全性毒理学评价程序3 定义精子畸形（sperm malformation）指精子形态的异常改变。

4 原理已知精子畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。

常染色体和Y-性连锁基因突变及某些染色体重排，如性-常染色体易位，也可使精子发生畸形。

小鼠精子畸形试验能评价受试物对精子生成、发育的影响，可检测受试物在体内对生殖细胞的遗传毒性作用。

5 试验的基本原则通过适当的途径使动物接触受试物，经过一定时间后处死动物，取其附睾，制备涂片，经固定、染色，在显微镜下计数畸形精子。

6 仪器和器械生物显微镜、解剖剪、镊子、表面皿、离心管、小漏斗、吸管、滴管、载玻片、擦镜纸等。

7试剂7.1 1%伊红染色液称取伊红1g溶于100mL蒸馏水中。

7.2 生理盐水、甲醇（A.R）8 实验动物和饲养环境常规使用动物是雄性小鼠。

6周~8周龄，体重为30g ~35g。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。

9 剂量分组受试物至少设三个剂量组。

分别取1/2、1/5、1/10或1/20LD50剂量。

当受试物的LD50大于5g/kg体重时，可取5g/kg体重为最高剂量。

另外设阴性（溶剂）对照组和阳性物对照组。

常用溶剂为水、生理盐水、植物油（玉米油、花生油）等。

阳性物对照组可采用环磷酰胺40mg/kg/日。

每组至少有5只存活动物。

10 染毒途径和方式染毒途径视实验目的而定。

常用途径为经口灌胃方式。

受试物各剂量组、阴性对照组和阳性物对照组的动物，均连续染毒5d，每日一次。

一般于首次染毒后的第35d处死动物。

11 试验方法11.1 制片用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，用眼科剪剖开附睾组织，与适量生理盐水混匀，涂片。