3种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测方法的研究

多重PCR方法快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌徐义刚;崔丽春;李苏龙;姜艳春;谢晓峰;刘新亮【摘要】肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)和侵袭性大肠埃希菌(EIEC)是引起腹泻的主要大肠埃希菌,威胁着食品安全和人类健康,建立同时检测4种致腹泻性大肠埃希菌的方法具有重要意义.基于ETEC LT肠毒素基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵袭性质粒特异性基因,设计了4对特异性引物,通过对单一PCR反应条件的优化建立了快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌的多重PCR方法,彼此之间无交叉反应.该多重PCR方法具有良好的特异性和灵敏性,对24株致病菌进行检测,所试4株致腹泻性大肠埃希菌均为PCR阳性,其他菌株则为阴性.实践证明,利用所建立的多重PCR方法对124份肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出15份阳性,与国标(GB 4789.6-1994)检测结果相同.结果表明本文建立的多重PCR方法可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的单一或混合感染的鉴别诊断及食品安全风险评估,具有良好的实用性.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2010(030)003【总页数】5页(P25-29)【关键词】致腹泻性大肠埃希菌;多重PCR;快速检测【作者】徐义刚;崔丽春;李苏龙;姜艳春;谢晓峰;刘新亮【作者单位】黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;东北林业大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】Q93大肠埃希菌(Escherichia coli)由Escherich于1885年首次发现,起初一直被认为是肠道菌群的正常组成部分,属于条件致病菌。

[作者简介]赵红庆(1983-),男,硕士研究生,主要从事病原菌检测方法研究。

*通讯联系人,E-m ai:l huang li uyu l y@1631co m =论著>多重PCR检测致腹泻大肠埃希菌方法的建立赵红庆,苑锡铜,王玉飞,陈泽良,黄留玉*(军事医学科学院疾病预防控制所,北京100071)[摘要]目的:建立一种快速、特异的能同时检测5种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR方法。

方法:针对5种致腹泻大肠埃希菌EPEC、E A EC、E I EC、ETEC、E H EC的毒力相关基因eae A、aggR、ipa H、lt、st x1A等设计相应的引物,通过系统摸索和优化反应条件,在一步PCR反应中能同时筛选5种大肠埃希菌的特异基因,建立了一种同时检测的多重PCR方法。

结果:确定了同时检测5种大肠埃希菌特异基因的条件,建立了一种同时检测5种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR方法。

结论:多重PCR方法是一种快速、高效的检测大肠埃希菌的方法。

[关键词]检测技术;临床实验室技术;分子诊断技术;多重聚合酶链反应;大肠埃希菌[中图分类号]R44615[文献标识码]A[文章编号]1004-8685(2009)10-2223-04Develop m ent of a multiplex PCR assay for detection of five kinds of diarrhea E scherichia coliZ H AO H ong-q ing,YUAN X i-tong,WAN G Yu-f ei,C H EN Z e-liang,H UANG L i u-yu*(Instit u te of D isease Contro l and P reven tion,A cade m y o fM ilitary M edical Sciences,Be iji ng10071,Ch i na)[Abstract]O b jective:T o deve l op a mu lti plex PCR m ethod w hich can qu i ckly and spec ificall y detect five k i nds o f d i arrhea E scher ichia coli si m u ltaneously1M ethods:F ive pa irs of pr i m ers targ eti ng to the v irulence assoc i a ted genes-eaeA,aggR,i paH, lt,stx1A spec ifi c to EPEC,E A EC,E IEC,ET EC,EHEC we re desi gned and synthes i zed1T he PCR reac ti on syste m and cond-i ti ons w ere opti m i zed to detect each o f the five k i nds o f E1co li1R esults:A fte r systema ti ca lly opti m izi ng t he reacti on system and cond iti ons,the five k i nds o f E1coli could be de tected and d ifferen tiated s i m u ltaneously1Conc l usion:M u lti plex PCR is a rap i d and efficient assay for specific de tecti on o f t he five k i nds of E1coli1[K ey words]Investigati ve techniques;C li n i ca l laboratory techniques;M o l ecular d i agnostic techn i ques;M u lti plex PCR;E sch-er ichi a coli根据致病机制和临床表现,将致腹泻大肠埃希菌分为五类,即肠致病性大肠埃希菌(enteropa t hogen ic E1coli,EPEC),肠积聚性大肠埃希菌(enteroagg regative E1coli,E A ggEC),肠侵袭性大肠埃希菌(ente ro i nvasi ve E1co li,E IEC),肠产毒性大肠埃希菌(en tero t ox igen ic E1coli,ET EC),肠出血性大肠埃希菌(en-terohe m orrhag i c E1coli,E HEC)。

腹泻症候群致泻性大肠埃希氏菌血清型及毒力基因检测目的：通过对腹泻症候群中致泻大肠埃希菌的血清型和多重PCR检测，了解本地区致泻大肠埃希菌的血清群、型分布规律，所携带毒力基因及相互之间的相关性，为腹泻症候群中致泻大肠埃希菌的检测、鉴定提供科学依据，以提高阳性株的检出率。

方法：对本地区2012-2013年腹泻症候群监测医院门诊未使用过抗生素腹泻患者的稀便、水样便、黏脓便或脓血便标本通过増菌、各种选择性培养基筛选出病原菌，后经生化试验、多重PCR试验和血清型分型试验进行鉴定。

结果：本次检测共检出65株血清凝集致泻大肠埃希菌，分属EPEC、EIEC、ETEC，以EPEC为主，占83.08%，共8个血清型，其中血清型O55：H59、O128：H67占58.47%；共检出4种相关毒力基因，其中escV 49株（75.38%）。

未分血清型菌株27株，检出相关毒力基因共5种，分属EPEC、EIEC、ETEC、EAEC，其中escV 15株（55.56%）。

结论：本地区腹泻症候群中血清学阳性致泻大肠埃希菌以EPEC为主，常见血清型为O55：H59、O128：H67，毒力基因为escV、escV+bfpB、invE、elt。

未分血清型致泻大肠埃希菌毒力基因为escV、escV+bfpB、invE、elt、astA，与已分型菌株携带基因基本一致。

腹泻患者的大肠埃希菌检测中，在传统的细菌分离培养、生化试验、血清学鉴定的基础上，有必要进行大肠埃希菌的毒力基因检测，以提高阳性检出率，避免漏检，提高致泻性大肠埃希菌的诊断。

标签：致泻大肠埃希菌；血清型；毒力基因【Abstract】Objective：To detect the serum type of diarrhea caused by Escherichia coli diarrhea syndrome and multiple PCR，understand the diarrhea caused by Escherichia coli serogroups，region based distribution，the correlation between virulence genes and their detection，identification，and provide scientific basis for diarrhea syndrome caused by large Escherichia coli，in order to improve the detection rate of positive strains.Method：The local diarrhea syndromic surveillance hospital unused，watery，sticky pus or purulent blood sample diluted by those bacteria，a variety of selective culture medium screening pathogen antibiotics in patients with diarrhea from 2012 to 2013 ，after biochemical test，multiple PCR test and serotype tests were identified.Result：65 strains serum agglutination of diarrheogenic Escherichia coli were detected and belong to EPEC，EIEC，ETEC，the EPEC accounted for 83.08%，a total of 8 serotypes，serotype O55：H59，O128：H67，which accounted for 58.47%；there were 4 kinds of virulence related genes，among them 49 were escV （75.38%）. Serum without typing were 27 strains，5 species of virulence related genes were detected，which escV had 15 strain （55.56%），belong to EPEC，EIEC，ETEC，EAEC.Conclusion：Local serological diarrhea syndrome is caused by Escherichia coli EPEC，common serotypes are O55：H59，O128：H67；virulence genes are escV，escV+bfpB，invE，elt. Serum without typing diarrheogenic Escherichia coli virulence genes are escV，escV+bfpB，invE，elt，astA，and consistent with typing of strains carrying genes. Detection of Escherichia coli diarrhea patients，basal medium，in bacterial isolation andconventional biochemical tests，serological identification，virulence gene detection is necessary to Escherichia coli，in order to improve the positive rate，to avoid detection，improve the diagnosis of diarrhea genic Escherichia coli.【Key words】Diarrhea escherichia coli；Serum type；Virulence genes致泻性大肠埃希菌生存与人和动物的肠道中，随粪便排出而污染水源、土壤、食品、器具等，人群对致泻大肠埃希菌普遍易感，根据其致病机制，致泻大肠埃希菌至少可分为5个类型：肠产毒素大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠集聚性黏附性大肠埃希菌（EAEC）。

几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价目的评价几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果。

方法根据大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因，设计相应的引物，并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。

并对市售经果汁样品人工随机染菌后进行模拟样品验证。

结果该多重PCR 方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段，且特异性较强。

同时能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。

结论利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。

标签：肠道致病菌；多重PCR检测；效果评价随着人们健康意识的提升，对于食品安全问题关注度逐渐提升。

对于食品安全事件来说，其中最大的元凶在于食源性致病菌的存在。

这些食源性致病菌的组成是多样性的，其中，金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌（伤寒沙门菌、肠炎沙门菌）、产气荚膜梭菌及变形杆菌等引起的食源性疾病居于世界前列。

在这种情况下，引起了医学界广泛的重视[1]。

在传统的致病菌检测过程中，常用的方法为生理生化、血清型水平等等，但是，以上种种方法具有测试时间较长，费时、费力等特点，在灵敏度测试方面具有一定的局限性。

故应建立一种较为快速、简便并具有一定灵敏度的检测方式，其中，以多重PCR检测最具效力，并成为研究的热门。

本次研究拟建一种多重PCR检测方式，可以有效的检测出单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157、副溶血性弧菌及普通变形杆菌4种肠道致病菌，以期达到临床检测效果，现报道如下。

1 资料与方法1.1一般资料菌种以及来源：副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌等均购于北京兰博瑞公司。

单核细胞增生李斯特菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、志贺氏、空肠弯曲菌及大肠杆菌O157等均保存于重庆市疾病预防控制中心。

肠道致病菌多重PCR快速检测体系研究(一)沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌，严重的危害着人类健康和牲畜的安全〔1〕。

因此，建立一种快速、简便、准确、特异地检测方法具有重要意义。

目前常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高，灵敏度低，或假阳性率高，特异性差等缺点。

PCR技术提供了理想的检测方法。

本实验采用多重PCR方法，可在同一反应体系中检测不同的细菌，整个过程只需要2～3h，应用前景广阔。

1材料与方法实验菌株肠炎沙门菌、阿柏丁沙门菌，鸡雏沙门菌，德尔比沙门菌、鼠伤寒沙菌，福氏志贺2a，福氏志贺2b，宋氏志贺菌，枸缘酸杆菌，变形杆菌，河弧菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌(四川省疾病预防控制中心)；产毒素大肠埃希菌C83921，产毒素大肠埃希菌C83902（中国兽医药品监察所）；侵袭性大肠埃希菌（中国生物制品研究所）。

试剂染料、缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、核酸染料(GV)、琼脂糖、Marker等(北京塞百盛基因技术公司)。

主要设备PCR基因扩增仪、台式高速离心机、紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪、微量加样枪(德国Eppendorf公司)；电泳槽、DYY-2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)。

方法引物设计沙门菌组氨酸转运操纵子基因片段具有沙门菌属特异性〔2-4〕，根据GenebankV01373提供的基因序列设计引物，即引物1:5＇-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3＇；引物2:5＇-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3＇由于ipaH基因存在于所有志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的质粒和染色体上〔5〕，根据GenebankM32063提供的序列设计志贺菌和EIEC引物,引物序列为:引物1：5＇-TGTATCACAGATATGGCATGC-3＇；引物2：5＇-TCCGGAGATTGTTCCATGTG-3＇。

专利名称：一种大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒及其检测方法专利类型：发明专利
发明人：佟春玉,崔玉东,宋佰芬,朱战波
申请号：CN201210199925.4
申请日：20120618
公开号：CN102690889A
公开日：
20120926
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括10×PCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，其中，引物包括检测ompT基因的引物、检测chuA基因的引物、检测yjaA基因的引物和检测TSPE4.C2基因的引物。

本发明在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4.C2基础上引入E.coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，四对引物联合使用，能够对待测样品是否为大肠埃希氏菌以及属于A、B、B、D哪个种系发育群进行快速鉴定，特异性高，可检测出样品中的痕量DNA，能够用于食品以及疾病诊断治疗应用。

申请人：黑龙江八一农垦大学
地址：163319 黑龙江省大庆市高新开发区新阳路2号
国籍：CN
代理机构：大庆市建华专利事务所
代理人：孙薇
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致泻性大肠埃希菌检测方式及结果分析作者：张雪来源：《科学导报·学术》2018年第27期摘要：目的；研究检测肠道感染中致泻性大肠埃希菌（DEC）的感染情况，了解本地区各种DEC的流行病学特征。

方法；对835例腹泻患者粪标本中分离出的大肠埃希菌，用荧光PCR法检测致病基因，鉴定DEC。

结果；共检测出148株DEC菌株（阳性率17.1%），其中，肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）14株，腸致病性大肠埃希菌（EPEC）22株，弥散聚集性大肠埃希菌（DAEC）28株和肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）65株，仅eastA阳性未能分组的19株。

6～10月共检出DEC90株。

0～13岁患者检出DEC菌株11株，阳性率10.8%（11/102）；>13～60岁患者检出DEC菌株108株，阳性率20.3%（108/532）；>60岁患者检出DEC菌株29株，阳性率14.4%（29/201）。

结论；DEC是引起肠道腹泻的主要致病菌之一，DEC的检出与季节和年龄有关。

分子生物学的检测方法更灵敏，临床实验室应选择更加灵敏的方法，加强对致泻性大肠埃希菌的检测。

关键词：大肠埃希菌，致泻性；致病基因；肠道感染；大肠埃希菌是人肠道中的正常菌群，其中有些菌株携带致病基因，能引起腹泻，称为致泻性大肠埃希菌（DEC）。

根据DEC的致病特点和携带的致病基因大致分为：肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）和弥散聚集性大肠埃希菌（DAEC）等。

DEC是引起腹泻的常见致病菌，其致病机制与致病基因或获得性毒力质粒有关，常规的细菌培养与鉴定方法不能鉴别各种致病性大肠埃希菌，检出率较低。

本研究用分子生物学方法检测大肠埃希菌的10种致病基因，以了解本地区肠道感染中DEC的感染及流行情况。

其中，eae、bfpa为EPEC 的致病基因，LT、ST为ETEC 的致病基因，ial 为EHEC 的致病基因，Aggr 为EAEC 的致病基因，draac 为DAEC 的致病基因，eastA为EAEC 的耐热肠毒素致病基因，VT1、VT2 为两种不同的VERO 毒素基因片段。