致泻大肠埃希式菌的检验
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大肠埃希氏菌生化鉴定结果大肠埃希氏菌(Escherichia coli)是一种常见的细菌,可以引起多种感染性疾病,包括腹泻、尿路感染和食物中毒等。
鉴定大肠埃希氏菌的生化特征可以帮助确定病原菌的身份以及其潜在的耐药性和毒力因子。
本次实验目的是对一株致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定,以确认其菌株的性质和特征。
首先,我们进行了气体产生实验。
在Triple Sugar Iron Agar(TSI)培养基中,观察到菌落周围发生了气体产生,此结果表明该菌株具有产气性。
产气性通常意味着大肠杆菌等需要葡萄糖产生酸,进而分解产生气体的细菌。
其次,我们进行了甲烷发酵试验。
在Methyl Red(MR)试剂中,当菌液发酵产酸时,溶液颜色由黄色变成红色。
然而,该菌株在MR试剂中没有产生红色反应,这表明它无法通过甲烷发酵产酸。
这一结果与典型的大肠杆菌不同,因为大肠杆菌通常可以通过此途径产酸。
进一步,我们进行了亮氨酸脱氨酶试验。
使用亮氨酸脱氨酶(LDC)培养基,如果菌株具有亮氨酸脱氨酶活性,菌液会变色。
然而,我们观察到该菌株在培养基中没有出现任何颜色变化,这表明它不具备亮氨酸脱氨酶活性。
亮氨酸脱氨酶活性通常是大肠杆菌的典型特征之一。
此外,我们还进行了尿素酶试验。
使用尿素平板培养基,如果菌株具有尿素酶活性,培养基颜色将由黄色变为粉红色。
然而,我们观察到该菌株在培养基上未显示出任何颜色变化。
这暗示着该菌株可能缺乏尿素酶活性,与大肠杆菌的典型特征不同。
最后,我们进行了青霉素酶试验。
使用青霉素酶试纸进行反应检测,在试纸上出现蓝色点状斑点表示菌株具有青霉素酶活性。
而对于这个菌株,我们观察到在试纸上没有出现蓝色斑点。
这意味着该菌株可能对青霉素类药物敏感,这对于抗生素选择治疗提供了重要信息。
综上所述,通过对致病性大肠埃希氏菌样本进行生化鉴定,我们发现该菌株具有产气性,但与典型的大肠杆菌不同,它不表现出甲烷发酵、亮氨酸脱氨酶和尿素酶活性。
分析检测基于多重PCR检测食品中致泻大肠埃希氏菌谭 波,黄坤宁*(贵州省检测技术研究应用中心,贵州贵阳 550014)摘 要:目的:提高实验室对食品中致泻大肠埃希氏菌(Diarrheagenic Escherichia coli,DEC)的检测能力与检测效率,验证DEC多重PCR试剂盒的适用性。
方法:依据《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》(GB 4789.6—2016)分离鉴定样品23-H770、23-X371,用DEC多重PCR检测试剂盒检测5种DEC的12条特征基因。
结果:23-H770未检出DEC,23-X371检出STEC/EHEC,阴、阳性对照菌种均检出GB 4789.6—2016中5种DEC目标条带与型别对照表相应基因条带,且空白对照12条目标基因条带均未检出。
结论:能力验证样品评价结果为“满意”,多重PCR检测试剂盒能快速准确检测EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC和EAEC。
关键词:多重PCR;致泻大肠埃希氏菌;电泳;检测Detection of Diarrheogenic Escherichia coli in Food Based onMultiplex PCRTAN Bo, HUANG Kunning*(Guizhou Testing Technology Research and Application Center, Guiyang 550014, China) Abstract: Objective: To improve the detection capability and efficiency of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) in food, and to verify the applicability of DEC multiplex PCR kit. Method: Samples 23-H770 and 23-X371 were isolated and identified according to GB 4789.6—2016, and 12 characteristic genes of 5 species of DEC were detected with DEC multiple PCR detection kit. Result: DEC was not detected in 23-H770, STEC/EHEC was detected in 23-X371, and GB 4789.6—2016 were detected in all the five DEC target bands and corresponding gene bands in the genotype comparison table, while none of the 12 target gene bands were detected in the blank control. Conclusion: The evaluation result of ability verification sample is satisfactory. The multiplex PCR kit can detect EPEC, EIEC, ETEC, STEC/EHEC and EAEC quickly and accurately.Keywords: multiplex PCR; diarrheagenic Escherichia coli; electrophoresis; detection致泻大肠埃希氏菌(Diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一类可引起人体腹泻症状的大肠埃希氏菌(Escherichia coli),常见的DEC主要有5种[1-2]。
埃希氏大肠菌及检验一、定义:大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌,分类于肠杆菌科,归属于埃希氏菌属,并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。
大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%,而与同科的志贺氏菌属(除鲍氏志贺氏菌外)的DNA相关性可达80-87%。
与人类疾病有关的大肠杆菌,统称为致泻性大肠杆菌(此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆),一般包括五种:即肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、致病性大肠杆菌(EPEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)和粘附性大肠杆菌(EAEC)。
文献报道还有几种,象:凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等,但目前尚未达成统一共识。
二、生物学特性:基本形态特征:此菌为两端钝圆的短小杆菌,一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同,个别菌体可呈近似球状或长丝状。
此菌多单独存在或成双,但不呈长链状排列。
约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动,但多数菌体只有1-4根,一般不超过10根,故菌体动力弱;多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛,有的菌株具有荚膜或微荚膜;不形成芽胞,对普通碱性染料着色良好,革兰氏染色阴性。
培养特征:由于此菌合成代谢能力强,在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃,在42-44℃条件下仍能生长,生长温度范围为15-46℃。
在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态:(1)光滑型:菌落边缘整齐,表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色,在生理盐水中容易分散。
(2)粗糙型:菌落扁平、干涩、边缘不整齐,易在生理盐水中自凝。
(3)粘液型:常为含有荚膜的菌株。
此菌兼性厌氧,在有氧条件下生长良好,最适生长pH为6.8-8.0,所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。
生化反应与血清学反应大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴,因此,必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义,在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上,可以应用I(吲哚)、M(甲基红)、Vi(3羟基-2-丁酮)、C(柠檬酸)即IMViC 生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定,其IMViC结果为++--或-+--。
腹泻症候群致泻性大肠埃希氏菌血清型及毒力基因检测目的:通过对腹泻症候群中致泻大肠埃希菌的血清型和多重PCR检测,了解本地区致泻大肠埃希菌的血清群、型分布规律,所携带毒力基因及相互之间的相关性,为腹泻症候群中致泻大肠埃希菌的检测、鉴定提供科学依据,以提高阳性株的检出率。
方法:对本地区2012-2013年腹泻症候群监测医院门诊未使用过抗生素腹泻患者的稀便、水样便、黏脓便或脓血便标本通过増菌、各种选择性培养基筛选出病原菌,后经生化试验、多重PCR试验和血清型分型试验进行鉴定。
结果:本次检测共检出65株血清凝集致泻大肠埃希菌,分属EPEC、EIEC、ETEC,以EPEC为主,占83.08%,共8个血清型,其中血清型O55:H59、O128:H67占58.47%;共检出4种相关毒力基因,其中escV 49株(75.38%)。
未分血清型菌株27株,检出相关毒力基因共5种,分属EPEC、EIEC、ETEC、EAEC,其中escV 15株(55.56%)。
结论:本地区腹泻症候群中血清学阳性致泻大肠埃希菌以EPEC为主,常见血清型为O55:H59、O128:H67,毒力基因为escV、escV+bfpB、invE、elt。
未分血清型致泻大肠埃希菌毒力基因为escV、escV+bfpB、invE、elt、astA,与已分型菌株携带基因基本一致。
腹泻患者的大肠埃希菌检测中,在传统的细菌分离培养、生化试验、血清学鉴定的基础上,有必要进行大肠埃希菌的毒力基因检测,以提高阳性检出率,避免漏检,提高致泻性大肠埃希菌的诊断。
标签:致泻大肠埃希菌;血清型;毒力基因【Abstract】Objective:To detect the serum type of diarrhea caused by Escherichia coli diarrhea syndrome and multiple PCR,understand the diarrhea caused by Escherichia coli serogroups,region based distribution,the correlation between virulence genes and their detection,identification,and provide scientific basis for diarrhea syndrome caused by large Escherichia coli,in order to improve the detection rate of positive strains.Method:The local diarrhea syndromic surveillance hospital unused,watery,sticky pus or purulent blood sample diluted by those bacteria,a variety of selective culture medium screening pathogen antibiotics in patients with diarrhea from 2012 to 2013 ,after biochemical test,multiple PCR test and serotype tests were identified.Result:65 strains serum agglutination of diarrheogenic Escherichia coli were detected and belong to EPEC,EIEC,ETEC,the EPEC accounted for 83.08%,a total of 8 serotypes,serotype O55:H59,O128:H67,which accounted for 58.47%;there were 4 kinds of virulence related genes,among them 49 were escV (75.38%). Serum without typing were 27 strains,5 species of virulence related genes were detected,which escV had 15 strain (55.56%),belong to EPEC,EIEC,ETEC,EAEC.Conclusion:Local serological diarrhea syndrome is caused by Escherichia coli EPEC,common serotypes are O55:H59,O128:H67;virulence genes are escV,escV+bfpB,invE,elt. Serum without typing diarrheogenic Escherichia coli virulence genes are escV,escV+bfpB,invE,elt,astA,and consistent with typing of strains carrying genes. Detection of Escherichia coli diarrhea patients,basal medium,in bacterial isolation andconventional biochemical tests,serological identification,virulence gene detection is necessary to Escherichia coli,in order to improve the positive rate,to avoid detection,improve the diagnosis of diarrhea genic Escherichia coli.【Key words】Diarrhea escherichia coli;Serum type;Virulence genes致泻性大肠埃希菌生存与人和动物的肠道中,随粪便排出而污染水源、土壤、食品、器具等,人群对致泻大肠埃希菌普遍易感,根据其致病机制,致泻大肠埃希菌至少可分为5个类型:肠产毒素大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠集聚性黏附性大肠埃希菌(EAEC)。
肠致泻性大肠埃希氏菌实验活动风险评估报告肠致泻性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种常见的食源性致病菌,可引起腹泻疾病,包括婴幼儿腹泻和旅行者腹泻等。
为了评估ETEC实验活动的风险,以下是一份1200字以上的报告。
一、实验目的本实验旨在了解ETEC的生物学特性,研究其感染机制和毒力因子,进一步为控制和预防ETEC引起的腹泻疾病提供参考和依据。
二、实验设备和试剂1.培养细菌的培养基和试剂:如LB培养基、大肠杆菌专用试剂盒等;2. 分离和鉴定ETEC的培养基和试剂:如MacConkey琼脂培养基、乳糖和肌醇培养基、血琼脂培养基等;3.测定毒力因子的试剂:如耐酸素和耐胆盐试剂盒、PCR试剂盒等;4.实验设备:如恒温培养箱、PCR仪等;5.操作用具:如培养皿、管嘴、移液器等;6.个人防护用具:如实验室外套、手套、护目镜等。
三、实验操作流程1.分离和纯化ETEC2.培养细菌3.鉴定并筛选ETEC4.检测ETEC的毒力因子5.分析实验结果四、潜在风险和安全措施1.细菌培养和操作过程中存在生物安全风险,可能导致实验室感染。
应严格遵守实验操作规范,佩戴个人防护用具,避免直接接触细菌培养物和废棄物。
2.试剂的使用应遵循使用说明,避免接触皮肤和吸入。
如有意外接触,应立即用清水冲洗,并向医生求助。
3.实验室内应保持清洁整洁,并进行定期消毒,以防止细菌污染和交叉感染。
4.实验室应设置生物安全柜,保证实验操作的无菌环境。
5.实验室工作人员应进行相关安全培训,了解应急处置措施和实验室紧急撤离计划。
五、应急处置措施1.如实验过程中发现细菌培养物泄漏或感染,应立即采取隔离措施,通知实验室负责人,并进行相应的消毒和清理。
2.如有人员接触细菌培养物或试剂导致皮肤或黏膜受伤,应立即用清水冲洗,并及时向医生求助。
3.如实验过程中发生火灾、泄露气体等紧急情况,应立即采取逃生措施,按照实验室紧急撤离计划进行撤离,并向实验室负责人报告。
沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验(三)5.4.1 沙门氏菌分型鉴定按GB4789.4举行。
假如判定为时,应得出完整的血清学分型鉴定的结果。
5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定 5.4.2.1 按GB4789.6和GB4789.36举行。
分别的菌株应当同时被同样的几个噬菌体裂解后,用分型噬菌体实验,这些菌株应当具有相同的裂解模式,同时测定IRTD噬菌体的裂解状况。
5.4.2.2 ,应有肠毒素实验的证明。
5.4.2.3 侵袭性大肠埃希氏菌,典型的生化特性为:实验阴性、无动力、产气或不产气(O124血清型亦可以为有动力、不产气),靛基质实验阳性。
可进一步做豚鼠角膜实验,结果应当为阳性,质粒电泳应证实具有120~140MdaI大质粒,PCR实验证实具有ipaC或ipaH基因。
5.4.2.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌O157:H7,典型的生化特性为:乳糖、蔗糖产酸,产酸并多数产气,阴性,靛基质阳性,山梨醇迟缓发酵。
PCR实验证实具有产志贺毒素基因strl,stx2和溶血毒素基因hly。
IRTD的E-2噬菌体裂解实验,能被IRTD的E-2噬菌体裂解(裂解程度包括从CL到少数几个噬斑)。
对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌,根据5.4.2.3的程序举行鉴定。
5.4.2.5 肠道致病性大肠埃希氏菌具有大肠埃希氏菌的典型生化特性,eαe基因(黏附屏蔽基因)的PCR实验为阳性。
产志贺毒素大肠埃希氏菌eαe实验也可为阳性。
EAF(黏附因子质粒基因)或物(菌毛捆绑形成基因)的PCR实验可进一步证明。
5.4.3 志贺氏菌分型鉴定 5.4.3.1 挑取上的培养物,按噬菌体裂解模式,选用相应的志贺氏菌分型因子血清,做玻片凝集实验。
血清学分型鉴定结果见表3。
表3 噬菌体实验的结果和志贺氏菌血清学分型鉴定的结果 5.4.3.2 如按噬菌体裂解模式结果为福氏志贺氏菌1~5型,先用福氏多价血清做凝集实验。
致泻大肠埃希氏菌检验标准
1. 范围
本标准规定了致泻大肠埃希氏菌检验的术语和定义、通用要求、样品采集与处理、实验室基本要求、检验程序、结果报告、记录和档案管理等要求。
本标准适用于食品、水源等样品的致泻大肠埃希氏菌检验。
2. 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
GB 4789.16 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
3. 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 致泻大肠埃希氏菌Escherichia coli causing diarrhea
能够引起人类腹泻症状的大肠埃希氏菌。
4. 通用要求
4.1 实验室应建立完善的生物安全制度,保证工作人员的安全和防护。
4.2 实验室应配备相应的仪器设备和试剂,保证检验的准确性和可靠性。
4.3 实验室应按照相关规定做好废弃物的处理和消毒工作,防止污染环境和危害人员健康。
5. 样品采集与处理
5.1 样品采集
5.1.1 食品样品:采集具有代表性的食品样品,包括原材料、半成品、成品等。
5.1.2 水源样品:采集具有代表性的水源样品,包括自来水、饮用水、地表水等。
5.2 样品处理
5.2.1 食品样品:将样品无菌包装或以其他方式保证无菌操作,避免交叉污染。
Quality Control国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议孟 静,钟立霞,郭颖慧,程祥龙,伊廷存,霍胜楠*山东省食品药品检验研究院,山东济南 250100摘 要:致泻大肠埃希氏菌O157:H7(STEC O157:H7)是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌,主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中,对身体健康造成很大危害,甚至引发死亡。
食品中STEC O157:H7检测尤为重要。
本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较,提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强,以便为该菌快速准确检测提供帮助,实现与国际标准化体系建设接轨,满足实验室检测需要。
关键词:致泻大肠埃希氏菌(STEC O157:H7);检验检测;国内外对比文章编号:1671-4393(2023)04-0076-07 DOI:10.12377/1671-4393.23.04.120 引言致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌,可污染食物引起发病。
O157:H7是其中一种血清型,能分泌志贺毒素,一旦感染,主要引发血性腹泻[1,2],严重的可发展为溶血性尿毒症综合征[3,4]、出血性结肠炎和永久性器官衰竭[5],这类产志贺毒素大肠埃希氏菌称为肠道出血性大肠埃希氏菌(STEC)。
感染STEC O157:H7的主要来源是食物,一般存在猪肉、禽肉、牛肉、牛奶、果汁、冷三明治、蔬菜和饮水等。
流行暴发大多因为食用被该菌污染的食物或未严格消毒饮用水。
STEC O157:H7还能通过人与人接触传播[6,7]。
由于食品基质复杂性、致病菌种类及污染途径,产品存在风险,新发布的《GB 29921—2021 食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》将牛肉制品、预切蔬菜水果等产品增加致泻大肠埃希氏菌的检测作者简介:孟 静(1979-),女,河北晋州人,硕士,正高级工程师,研究方向为食品检验检测;钟立霞(1989-),女,山东临朐人,硕士,工程师,研究方向为食品检验检测;郭颖慧(1989-),女,山东济南人,硕士,高级工程师,研究方向为食品检验检测;程祥龙(1992-),男,山东临沂人,硕士,工程师,研究方向为食品检验检测;伊廷存(1982-),男,山东蒙阴人,硕士,高级工程师,研究方向为食品安全检验检测技术研究。
食品致泻大肠埃希氏菌检验原始记录
样品编号:检验开始时间:年月日
样品名称:检验完成时间:年月日检测项目:致泻大肠埃希氏菌检测依据:GB4789.6-2016
无菌操作称(量)取固体或半固体样品25g加入225ml营养肉汤均质杯中;液体量取25mL 装入225mL营养肉汤的无菌锥形瓶中(可加适量玻璃珠),36±1℃培养6h;取10μL接种于肠道增菌肉汤管内,于42±1℃培养18h。
将增菌液划线接种于MAC和EMB营养琼脂平板,于36±1℃培养18~24h
观察菌落形态,挑取可疑菌落在做生化鉴定及PCR确认试验。
注:+生长或有可疑菌落;-未生长或无可疑菌落。
电子天平编号:使用状况试验前:试验后:培养箱编号:使用状况试验前:试验后:检测人:校核人:审核人:。
致泻性大肠埃希氏菌PCR多重检测方法建立目前国内检测致泻大肠埃希氏菌的现行有效方法是GB/T 4789.6-2003,该方法主要从分离培养、生化试验、血清学试验和肠毒素试验对致泻性大肠埃希氏菌进行鉴定,本方法虽然不需要贵重仪器设备、费用低,但是耗时较长,实验所用的试剂不易买到,实验过程干扰因素较多。
由于该类菌与普通大肠埃希氏菌生化反应相似,在分离平板上菌落形态近似,因此从平板上反应上挑取可疑菌落就很困难,只有多挑取可疑菌落进行下一步的鉴定才能增加样品中检出致泻性大肠埃希氏菌的几率。
而多挑取菌落进行鉴定又增加了人力物力的消耗。
由于致泻性大肠埃希氏菌包含5种,因此对挑取的单个菌落要同时进行EPEC,ETEC,EIEC,EHEC 和EAEC的检测,半轴繁琐,复杂。
分子生物学尤其是PCR方法以其快速、简便,灵敏度高,特异性强等特点,越来越多的应用于病原体毒力基因的检测,而大肠埃希氏菌的致泻性主要取决于是否携带相应的独立因子,因此该技术特别是多重PCR技术特别适合于5种致泻大肠埃希氏菌多种毒力基因的检测。
多重PCR技术,可以在一个反应体系中进行多个目的基因片段的PCR扩增,快速获得致病菌种属、型别和毒力基因的扩增结果。
美国早在2008版BAM上将PCR检测技术应用到致泻性大肠埃希氏菌的鉴定。
近年来,许多学者进行了该方面的研究,但仅限于一种致泻大肠的毒力基因和种属基因的检测,而同时对五种致泻大肠埃希氏菌进行鉴定的多重PCR试剂盒未见报道。
天津生物芯片开发的五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒通过同步扩增致泻性杆菌菌典型毒力基因,快速实现对EPEC/ EHEC/ ETEC/ EIEC/ EAEC等五种致泻性大肠埃希氏菌的型别划分和鉴定。
【预期用途】用于食品、饮用水、临床样品以及环境样品中的五种致泻性大肠杆菌(EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC)的分型检测。
【检验原理】五种致泻性大肠杆菌(EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC)共含有11种毒力基因,针对这11种毒力基因,试剂盒使用11对特异引物,与样本中基因组的相应靶位点特异性结合,PCR反应后,不同类型的样本产生不同的扩增片段,从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。