五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒...

致泻大肠埃希氏菌的危害程度评估报告Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】致泻大肠埃希氏菌危害程度评估报告一、生物学特性大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，统称为致泻性大肠杆菌，一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。

大肠埃希氏菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。

此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。

约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。

在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：光滑型、粗糙型、粘液型。

大肠埃希氏菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。

大肠埃希氏菌生华物性是，发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，分解蔗糖因菌株而异，录素酶试验阴性，IMVi试验++--，有些菌株如碱性异型菌群，微产碱，不产气，无动力，易与志贺菌混淆。

大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。

现巳知有171个O抗原、99个K抗原和56个H抗原。

二、危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。

三、致病性和感染剂量致泻大肠埃希氏菌在人和动物的大便中大量存在，引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。

中国检验检测202丨年第1期食品中肠道出血性大肠埃希氏菌能力验证结果分析与讨论马蓉吉瑞周露马秋莲朱聿元(宝应县产品质量综合检验检测中心，宝应225800)摘要：为了提升实验室对食品中肠道出血性大肠埃希氏菌的检测能力，增强实验室竞争能力，本实验室参加了认监委 组织的食品中肠道出血性大肠埃希氏菌检测能力验证活动依据GB4789. 6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致 泻大肠埃希氏菌检验》，采用PCR方法检测毒力基因，对疑似菌进行鉴定。

发现编号19-H566和19-L321样品均检出肠道出 血性大肠埃希氏菌。

说明利用PCR方法检测致泻性大肠埃希氏菌的毒力基因能够有效的鉴别其致病型。

关键词：能力验证;肠道出血性大肠埃希氏菌;PCR检测中图分类号:TS201.3 文献标识码：A DOI：10. 16428/lO-1469/tb.2021. 01.030〇引言大肠埃希氏菌属于大肠埃希氏菌属，广泛分布在 人体和自然界中，大部分菌种对人体不会产生危害i l]。

但是，有些带有致病基因的菌种会引起人类肠道感染，并可引发致死性并发症:2],这类菌株被称为致泻性大 肠埃希氏菌(DEC)。

根据致泻性大肠埃希氏菌的致病 情况不同可将其分为5种类型及11种相关毒力基因：肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、肠道侵袭性大肠埃 希氏菌(EIEC)、肠道致病性大肠埃希氏菌（EPEC)、肠 产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、肠粘附性大肠埃希氏 菌(EAEC)。

其中，肠道出血性大肠埃希氏菌为最严重 的一种致病性大肠埃希菌，自1983年以来多次在世界 各地广泛流行，对人类的健康构成极大威胁11。

肠道 出血性大肠埃希氏菌的感染基本属于食源性疾病，牛 肉、牛奶、鸡肉、蔬菜、水果、饮料及水等均可成为传染 源0]，因此，对食品中肠道出血性大肠埃希氏菌的检测 就显得尤为重要。

然而，传统的微生物学分离、鉴定以 及血清学方法在检测病原微生物方面日益显现不足，PCR技术，B P聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)以其快速、灵敏以及特异性强的优势，成为了病 原微生物快速鉴别与分型的重要技术之一。

分析检测腹泻病例中5种致泻性大肠埃希菌的分子分型研究王雪梅，张 苗（淄博市疾病预防控制中心，山东淄博 255206）摘 要：目的：对腹泻病例中致泻性大肠埃希菌（DEC）进行PCR毒力基因检测，了解其流行特征，通过脉冲场凝胶电泳确定菌株之间的相关性，为预防疾病提供技术支持。

方法：采集腹泻患者粪便，利用毛细管电泳仪对可疑DEC进行确认，收集患者信息，采用PFGE技术进行分子分型，用BioNumerics 软件进行聚类分析。

结果：检出的92例DEC阳性病例中，0～12岁患者15例；13～44岁患者60例；45～59岁患者9例；≥60岁患者8例。

92株DEC中共有89种带型，DNA条带相似度为9.36%～100.00%。

结论：不同年龄人群检出率有所差异，年龄在13～44岁检出率最高。

DEC菌株分子分型带型分散，呈现高度多态性。

关键词：致泻性大肠埃希菌；流行特征；脉冲场凝胶电泳Molecular Typing of Five Diarrheagenic Escherichia coliin Diarrhea CasesWANG Xuemei, ZHANG Miao(Zibo Center for Disease Control and Prevention, Zibo 255206, China) Abstract: Objective: PCR virulence gene detection of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) in diarrhea cases was carried out to understand its epidemic characteristics. The correlation between strains was determined by pulsed field gel electrophoresis, provide technical support for disease prevention. Method: Collect feces from diarrhea patients, confirm suspicious DEC using capillary electrophoresis, collect patient information, use PFGE technology for molecular typing, and use BioNumerics software for cluster analysis. Result: Among the 92 DEC positive cases detected, there were 15 cases aged 0～12 years old; 60 patients aged 13～44; 9 cases detected between 45 and 59 years old; 8 patients ≥60 years old. 92 strains of DEC have a total of 89 band types, with a DNA band similarity of 9.36%～100.0%. Conclusion: The detection rate varies among different age groups, with the highest detection rate occurring between the ages of 13 and 44. The molecular typing bands of DEC strains are scattered and exhibit high polymorphism.Keywords: diarrheagenic Escherichia coli; popular characteristics; pulsed field gel electrophoresis大肠埃希氏菌是人体的正常菌群，后来人们发现某些大肠埃希菌可引起腹泻并在人群中流行，称为致泻大肠埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）。

多重PCR法在食品中致泻大肠埃希氏菌质控考核中的应用摘要：目的通过多重PCR方法检测质控样本中致泻性大肠埃希氏菌方法：参照GB4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学致泻大肠埃希氏菌菌检验》进行检验，结果编号15-1样品检出EHEC，15-2样品检出ETEC。

本实验室顺利完成考核，结果与考核方一致。

结论：多重PCR法在质控考核中，能够对目标菌快速鉴别，能够快速顺利完成质控考核，同时了解该实验室检验能力和实验室质控水平，提高检验机构出具检验数据的可靠性和有效性，保证实验室的检测水平。

关键词：质控考核；致泻大肠埃希氏菌；多重PCR1.引言大肠埃希氏菌俗称大肠杆菌，是人类和动物的肠道中重要的正常菌群，为宿主提供一些有营养作用的合成代谢产物。

多数大肠埃希氏菌并不致病，当机体抵抗力下降或侵入肠外组织或器官时，可作為条件致病菌而引起肠道外的感染，引起胃肠炎的大肠埃希氏菌分为五类即肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和粘附性肠埃希氏菌（EAEC）[1]。

快速检测和鉴定病原菌是及时有效地控制与预防传染病传播的重要手段。

传统的微生物学分离与鉴定以及血清学方法在鉴别与鉴定病原微生物方面日益显现出不足。

PCR法快速、敏感、特异，是对病原菌快速鉴别与分型的重要技术之一，而多重PCR更以其突出的优越性得到了广泛的应用[2]。

2.材料与方法2.1样品样品编号为15-1，15-2，每份考核样品包含西林瓶1个，西林瓶中装有白色冻干菌球。

本次考核共计2份样品。

2.2试剂及仪器营养肉汤、肠道菌增菌肉汤、麦康凯琼脂（MAC）、伊红美蓝琼脂（EMB）、三糖铁（TSI）琼脂、大肠埃希氏菌生化套盒、无菌双蒸水，以上试剂均使用北京路桥。

五种致泻大肠埃希氏菌DNA提取试剂盒、多重PCR及实时荧光PCR试剂盒均使用北京卓诚惠生，实时定量PCR仪器（BIO-RAD公司），凝胶成像仪（BIO-RAD公司），电泳仪。

大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒组成:干制生化鉴定试剂:4种/盒×10 盒;0.5麦氏浊度比浊管:1支;配套试剂:Kovacs氏靛基质试剂1瓶、甲基红试剂1瓶、V-P甲、乙液试剂各1瓶; 使用说明书:1份实验操作步骤:
1. 从铝箔袋中取出试剂盒,打开盒盖,在试剂盒的长条槽中加入0.5mL无菌水;2. 用接种环从平板上挑取新鲜培养的单个纯菌落至适量无菌水中,制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液;3. 接种菌悬液分别至试剂盒的4个圆孔中,每孔接种量0.2mL,盖上盒盖,36℃±1℃培养24h。

结果判定:保存条件和保质期:室温避光保存1年。

其他相关试剂盒：名称用途及用法大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 用于大肠杆菌的IMVC 生化系统鉴定(GB4789.38-2012)，包括蛋白胨水、MR、VP和西蒙氏枸橼酸盐共 4 种生化鉴定试验和配套试剂(靛基质、甲基红、VP甲乙液)阪崎肠杆菌干制生化鉴定试剂盒Enterobacter sakazakii Dehydration Biochemical Identification Kit 用于阪崎肠杆菌的生化鉴定(GB4789.40-2010)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、西蒙氏柠檬酸盐、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蜜二糖、D-蔗糖和苦杏仁苷共10种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡)志贺氏菌干制生化鉴定试剂盒Shigella Dehydration Biochemical Identification Kit 用于志贺氏菌的生化鉴定(GB4789.5-2012)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、靛基质、尿素、水杨苷、七叶苷、甘露醇、棉子糖、ONPG、甘油、葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸对照、粘液酸、三糖铁、半固体共17 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒Listeria Monocytogenes Dehydration Biochemical Identification Kit 用于单增李斯特氏菌的生化鉴定(GB4789.30-2010)，包括MR、VP、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、木糖、甘露醇、七叶苷共8 种生化鉴定试验和配套试剂(糖发酵添加剂、甲基红、VP 甲乙液)沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒Salmonella Dehydration Biochemical Identification Kit 用于沙门氏菌的生化鉴定(GB4789.4-2010)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、氰化钾对照、氰化钾、靛基质、尿素、甘露醇、山梨醇、ONPG、三糖铁共10 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)大肠埃希氏菌O157:H7干制生化鉴定试剂盒E.coli O157:H7 Dehydration Biochemical Identification Kit 用于大肠埃希氏菌O157:H7/NM的生化鉴定(GB/T4789.36-2008)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、MR、VP、靛基质、西蒙氏柠檬酸盐、纤维二糖、棉子糖、三糖铁、半固体共11种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质、甲基红、VP甲乙液)蜡样芽孢杆菌干制生化鉴定试剂盒Bacillus cereus Dehydration Biochemical Identification Kit 用于蜡样芽孢杆菌的生化鉴定(GB 4789.14-2014)，包括葡萄糖、VP、硝酸盐、明胶、动力培养基(蜡样)、甘露醇、西蒙氏柠檬酸盐、溶菌酶肉汤共8种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、硝酸盐还原甲乙液、VP 甲乙液)副溶血性弧菌干制生化鉴定试剂盒Vibrio parahaemolyticus Dehydration Biochemical 用于副溶血性弧菌的生化鉴定(GB 4789.7-2013)，包括无盐胨水、6% 盐胨水、8% 盐胨水、10% 盐胨水、葡萄糖、蔗糖、乳糖、Identification Kit 甘露醇、氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、VP、ONPG、3%NaCl三糖铁、3%NaCl半固体共16种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、糖发酵添加剂、VP甲乙液)致泻大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒Diarrheogenic E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 用于致泻大肠埃希氏菌的生化鉴定(GB/T4789.6- 2003)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、氰化钾对照、氰化钾、靛基质、尿素、三糖铁、半固体共8种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)小肠结肠炎耶尔森氏菌干制生化鉴定试剂盒Yersinia enterocolitica Dehydration Biochemical Identification Kit 用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化鉴定(GB/T 4789.8-2008)，包括氨基酸对照、鸟氨酸脱羧酶、VP、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、尿素、半固体共10 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、糖发酵添加剂、VP 甲乙液)。

5种致泻大肠埃希氏菌不同浓度下的国标法检出率分析胡春红，陆其聪*（四川省轻工业研究设计院有限公司，四川成都 610081）摘　要：目的：研究5种致泻大肠埃希氏菌使用GB 4789.6—2016法检测时，不同初始浓度下，二次增菌取不同接种体积的检出率。

方法：不同初始浓度下（1～3 CFU·mL-1，10～30 CFU·mL-1，100～300 CFU·mL-1）的5种致泻大肠埃希氏菌加入营养肉汤增菌后，取不同体积（10 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL）的预增菌液接种于肠道增菌肉汤管中，培养后划线于伊红美蓝琼脂（Eosin-Methylene Blue，EMB）和麦康凯琼脂（MacConkey Agar，MAC）平板，观察并记录平板中菌落生长情况，计算检出率。

结果：5种致泻大肠埃希氏菌接种量在10 CFU及以上时，二次增菌时取10 μL预增菌液至肠道增菌肉汤中，均能检出。

5种致泻大肠埃希氏菌接种量在1～3 CFU时，二次增菌时取10 μL和50 μL预增菌液至肠道增菌肉汤中，平均检出率均不能达到100%；二次增菌时接种体积增加到100 μL时，肠道集聚性大肠埃希菌EAEC（CICC24186）、肠出血性大肠埃希菌EHEC（CICC24187）、产肠毒素大肠埃希菌ETEC（CICC24190）的检出率能达到100%，而肠道侵袭性大肠埃希菌EIEC（CICC24188）、肠道致病性大肠埃希菌EPEC （CICC24189）的检出率仍不能达到100%。

结论：在实际检测工作中，在所检样品中致泻大肠埃希氏菌含量较低时，可以考虑增加二次增菌的接种量，减少漏检可能。

关键词：致泻大肠埃希氏菌；国家标准方法；检出率Analysis of the Detection Rate of 5 Kinds of Diarrheagenic Escherichia Coli at Different Concentrations by NationalStandard MethodHU Chunhong, LU Qicong*(Sichuan Light Industry Research and Design Institute Co., Ltd., Chengdu 610081, China) Abstract: Objective: To study the detection rates of 5 types of diarrhea causing Escherichia coli using the GB 4789.6—2016 method at different initial concentrations and different inoculation volumes for secondary enrichment. Method: Five types of diarrhea causing Escherichia coli at different initial concentrations (1～3 CFU·mL-1, 10～30 CFU·mL-1, 100～300 CFU·mL-1) were added to nutrient broth for enrichment, and different volumes (10 μL, 50 μL, 100 μL, 500 μL, 1 000 μL) inoculate the pre enrichment solution into the intestinal enrichment broth tube, and after cultivation, line it on eosin methylene blue (EMB) and macconkey agar (MAC) plates. Observe and record the bacterial colony growth in the plates, and calculate the detection rate. Result: When the inoculation amount of 5 types of diarrhea causing Escherichia coli was 10 CFU or above, 10 μL of pre enriched liquid was taken into the intestinal enrichment broth during the second enrichment, and all of them could be detected. When the inoculation amount of 5 types of diarrhea causing Escherichia coli is 1～3 CFU, 10 μL and 50 μL of pre enriched liquid are taken during the second enrichment into the intestinal enrichment broth, and the average detection作者简介：胡春红（1991—），女，四川内江人，本科，助理工程师。

五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒研发背景大部分的大肠杆菌是人或动物倡导的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病。

致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发。

根据发病机制、临床特征、流行病学特征、O抗原血清及细菌的毒力测定，可将致泻大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌（EPEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、粘附性大肠杆菌（EAEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）。

目前针对致泻大肠杆菌的常规实验室检测方法仍然较为薄弱，需要研究快速、简便、准确的分子生物学方法。

【检验原理】五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，天津生物芯片试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。

【使用方法】1.试剂配制（试剂准备区）从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。

设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。

计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。

2.PCR扩增（扩增和产物分析区）将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。

向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。

将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时：Step 1 94℃ 5minStep 2 94℃ 30sStep 3 63℃ 30s 30 个循环Step 4 72℃ 90sStep 5 72℃ 5min3.结果判断（扩增和产物分析区）从PCR管中取出2μl PCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。