下载文档原格式
高速逆流色谱仪原理高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography ，HSCCC ）是20 世纪80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。
它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。
目前HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。
我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。
美国FDA 及世界卫生组织（WHO ）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90 年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
1.逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化，溶剂耗量大，分离时间长。
2.20世纪70年代，出现了液滴逆流色谱（DCCC）特点：（1）流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES）（2）分离时间过长、连接处容易出现渗漏等3.20世纪70年代出现了离心分配色谱仪（Centrifugal partition chromatography，CPC）特点：（1）基于流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES），利用公转产生的单一力场（2）连接处较多而且容易出现渗漏，清洗维护复杂4．20世纪80年开始出现了现在的高速逆流色谱，可称为最先进的逆流色谱特点：（1）基于流体动力学原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）（2）通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相程5.HSCCC分离流程图举例1．高速逆流色谱分离黄柏中的小檗碱和巴马亭1实验部分1. 1仪器与试剂HSCCC2TBE300 型高速逆流色谱仪, 深圳同田生化有限公司;HD2212C2B 核酸蛋白检测仪, 上海康华生化仪器厂;R2201 旋转蒸发器, 上海申胜生物技术有限公司;LC210A T 高效液相色谱仪, 日本岛津色谱仪器公司;氯仿、甲醇、正丁醇、乙酸均为国产分析纯, 水为重蒸水, 黄柏购于杭州胡庆余堂, 为川黄柏。
高速逆流与制备色谱技术在射干有效成分分离中的应用的开题报告一、研究背景射干作为一种常见的中草药，广泛应用于临床中，具有清热解毒、活血化瘀等功效。
然而，射干中含有多种活性成分，如黄酮类化合物、多糖等，这些成分具有不同的结构和性质，因此需要采用有效的分离提取技术进行分离纯化。
高速逆流色谱（HSCCC）作为一种新兴的分离技术，具有无需固定填料、高分离效率、不破坏样品等优点，已经被广泛应用于中草药有效成分的分离纯化中。
另外，制备色谱也是常用的中草药有效成分分离技术之一，可以通过优化条件获得高纯度的有效成分。
二、研究内容和意义本次研究的内容为采用HSCCC技术和制备色谱技术对射干中的有效成分进行分离纯化，并对所得到的纯化产物进行结构分析和生物活性研究，旨在探讨这两种技术在中草药有效成分分离中的应用，并为射干的深入研究提供基础数据。
三、研究方法和步骤1、样品制备：选取干燥的射干样品，粉碎并筛选过滤得到粉末状样品。
2、HSCCC分离：采用对流式高速逆流色谱对射干样品进行分离纯化，考察流速、回转速度和两相体积比等条件对分离效果的影响。
3、制备色谱分离：采用制备色谱对HSCCC所得产物进行进一步纯化，考察柱填料种类、洗脱剂种类及浓度对分离效果的影响。
4、结构分析和生物活性研究：通过质谱和核磁共振进行纯化产物的结构鉴定，通过抑菌试验等进行生物活性评价。
四、预期结果通过采用HSCCC和制备色谱技术对射干中的有效成分进行分离纯化，预期可以得到高纯度、高产率的有效成分，并对其结构和生物活性进行分析研究，为射干的深入开发利用提供基础数据，同时探讨并发展中草药有效成分分离纯化的技术和方法。
![一种高纯度石杉碱甲的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/70d14b69e53a580217fcfeb0.png)
专利名称：一种高纯度石杉碱甲的制备方法专利类型：发明专利
发明人：王少珍,邓秋云
申请号：CN200410052688.4
申请日：20040709
公开号：CN1587260A
公开日：
20050302
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用高速逆流色谱法(HSCCC)从石杉属植物千层塔中分离高纯度石杉碱甲的制备方法。
它包括制备上相固体相，下相流动相的溶剂体系：正构烷烃如正庚烷、正己烷、或正戊烷；脂肪醇是甲醇、乙醇、或正丁醇、或丙酮和水组成，三组分的体积比依次为：1－5∶0.1－2∶1－5。
条件温度20℃－30℃，用固定相存满柱子，主机转速600－1000rpm，以0.5－4mL/min的流速将流动相泵入柱内；待体系动态平衡后，进样阀进样；根据监测器接收目标成分。
馏分浓缩蒸干后结晶，得到石杉碱甲单体。
本方法适用各种型号高速逆流色谱仪和各种含量石杉碱甲制备，具有分离量大，回收率高，操作简便的特点。
申请人：上海同田生化技术有限公司
地址：200122 上海市浦东新区浦东南路1279号华融大厦1311室
国籍：CN
代理机构：上海开祺专利代理有限公司
代理人：黄志达
更多信息请下载全文后查看。
天然产物研究与开发Nat Prod Res Dev 2006,18:2982301文章编号:100126880(2006)022******* 收稿日期:2005201221 接受日期:20052032033通讯作者T el :86228266062310;E 2mail :ixzijt @石杉碱甲提取工艺研究刘建廷,黎 艳,严 伟3(四川师范大学生命科学学院,成都610066)摘 要:以蛇足石杉为原料,采用生物碱分离的传统方法,通过盐酸浸提,氯仿萃取来制取、纯化石杉碱甲,选出最佳、最经济的生产工艺配方是:料液比为1:10,浸泡10h ,酸解3次,每次为45min ,酸解pH 值为3.0,酸解温度为55℃,碱化pH 为9.0;纯化过程中,用相当于石杉碱甲溶液体积15%的活性炭在pH 为3.0条件下除杂,石杉碱甲的得率大于79.4%。
关键词:石杉碱甲;制备工艺;提取;纯化;pH 中图分类号:R28412文献标识码:AStudy on the Extraction of H uperzine ALI U Jian 2ting ,LI Y an ,Y AN Wei 3(College o f Life Science ,Sichuan Normal Univer sity ,Chengdu 610066,China )Abstract :Huper zia serrata (Thunb )T rev.is raw material.T raditional method for alkaloid is olation was ly ,The raw material was processed in hydrochloric acid and alkaloids were extracted by chloroform.The optimal extracting procedure was selected as following :1:10for the ratio of material to acid ,10hours of s oaking time ,subsequently ,material was processed 3times in pH =3.0,55℃and 45minutes each time ,acid was basified to pH =9.0.In the condition of pH 3.0,im purities were rem oved by active carbon which were treated with acid liquid and 15:100for the ratio of s olid to liquid.Obtain rate of Huper zia serrata (Thunb )T rev.is m ore than 79.4%.K ey w ords :Huperzine A ;Processing ;extraction ;purification ;pH 蛇足石杉(Huper zia serrata (Thunb )T rev.)又名千层塔,常用来治疗重症肌无力、跌打损伤等症[1]。
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.02.12C N 103570621A (21)申请号 201310295691.8(22)申请日 2013.07.15201310183591.6 2013.05.17 CNC07D 221/22(2006.01)(71)申请人浙江万邦药业股份有限公司地址317500 浙江省温岭市城东街道百丈北路28号(72)发明人赵守明 陈平 彭少平 庄银枪石荣珍 谢金生 谢蔚华(74)专利代理机构北京华科联合专利事务所(普通合伙) 11130代理人王为孟旭(54)发明名称一种（-）-石杉碱甲的制备(57)摘要本发明涉及一种(-)-石杉碱甲的制备方法，所述方法是将化学合成得到的(+)-石杉碱甲混合物，在适宜条件下与手性酸形成石杉碱甲手性酸盐，该手性酸盐经有机溶剂重结晶，碱游离，得到光学纯的(-)-石杉碱甲，该方法操作方便，适合工业化生产；采用该方法得到的(-)-石杉碱甲化学纯度和光学纯度均大于99.5%，满足了制药行业对原料药纯度的要求。
(66)本国优先权数据(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书23页 附图9页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书23页 附图9页(10)申请公布号CN 103570621 A1.一种(-)-石杉碱甲的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）将(+)-石杉碱甲与手性酸成盐，得到(-)-石杉碱甲手性酸盐；2）将(-)-石杉碱甲手性酸盐脱盐得到(-)-石杉碱甲；（D）-二苯甲酰酒石酸、（D）-酒石酸、（D）-苹果酸、其中步骤1）中所述手性酸选自：（D）-扁桃酸和（D）-樟脑磺酸；步骤1）所述成盐是将(+)-石杉碱甲与手性酸在溶剂中反应得到，其中所述溶剂选自：丙酮和水、乙醇和水的混合溶剂。
（D）-二2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中步骤1）中所述手性酸选自：苯甲酰酒石酸；步骤1）中所述溶剂选自：丙酮和水、乙醇和水的混合溶剂，其中，丙酮和水的比例为1:1-5:1；乙醇和水的比例为1:1-5:1，(+)-石杉碱甲和手性酸摩尔比范围为1:0.5至1:2。
高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体
高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体
陈建华;黄少烈;李忠
【期刊名称】《中国现代应用药学》
【年(卷),期】2006(023)004
【摘要】目的从千层塔植物提取物中分离制备石杉碱甲单体.方法利用高速逆流色谱技术,通过寻找合适的两相溶剂体系及工艺参数,研究及讨论石杉碱甲分离制备的新方法.结果以n-Hexane/n-BuOH/H2O (4:1:5,V/V/V)为两相溶剂体系,在优化的工艺参数条件下,利用高速逆流色谱技术,获得了单体纯度为98.6%(HPLC)的石杉碱甲单体.结论利用高速逆流色谱技术成功地从千层塔植物提取物中分离制备了纯度高于98%的石杉碱甲单体.
【总页数】3页(295-297)
【关键词】高速逆流色谱(HSCCC);石杉碱甲;千层塔(蛇足石杉);植物单体制备【作者】陈建华;黄少烈;李忠
【作者单位】华南理工大学化工与能源学院广东省绿色化学产品技术重点实验室,广州,510640;华南理工大学化工与能源学院广东省绿色化学产品技术重点实验室,广州,510640;华南理工大学化工与能源学院广东省绿色化学产品技术重点实验室,广州,510640
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
【相关文献】
1.高速逆流色谱结合制备型高效液相色谱法分离制备大豆皂苷单体[J], 黄玉艾; 严明霞; 赵大云。
制备型液相色谱法分离千层塔中石杉碱甲
赵新燕
【期刊名称】《机电信息》
【年(卷),期】2011(000)014
【摘要】采用高效液相色谱技术,分离制备千层塔中石杉碱甲。
制备色谱条件：色谱柱（ID63×700mm,DiamonsilC18,粒径25～40μm）;流动相：氯仿—甲醇—氨水（840：24：1.2）;流速：70mL/min;检测波长：311nm;进样体积5mL。
1.6kg千层塔可提取出320mg石杉碱甲（纯度〉90%）。
采用高效液相色谱方法进行了纯度检测,符合纯度要求。
【总页数】3页(P1-3)
【作者】赵新燕
【作者单位】聊城万合工业制造有限公司,山东聊城252022
【正文语种】中文
【中图分类】O657.72
【相关文献】
1.高速逆流色谱结合制备型高效液相色谱法分离制备大豆皂苷单体 [J], 黄玉艾;严明霞;赵大云
2.制备型液相色谱法分离千层塔中石杉碱甲 [J], 赵新燕
3.半制备型液相色谱法分离纯化茶叶鲜叶中7种儿茶素类化合物 [J], 龚智宏;陈思;高江涛;李梅红;汪厦霞;林军;俞晓敏
4.制备型高效液相色谱法从秦艽中分离制备龙胆苦苷 [J], 张兴旺;陶燕铎;梅丽娟;
邵赟;文怀秀;赵晓辉
5.千层塔中石杉碱甲提取分离工艺研究 [J], 李玉山
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体陈建华*，黄少烈，朱宝璋，刘会法华南理工大学.化工与能源学院.华工－普源天然产物分离纯化技术开发中心中国.广州.510640摘要利用高速逆流色谱技术，在6个小时内从千层塔植物提取物中获得8个成分部位。
其中一个部位经高效液相色谱分析测定，确定为石杉碱甲且其单体的纯度高于98%。
工艺所用的高速逆流色谱两相溶剂体系为n-Hexane/n-BuOH/H2O (4:1:5,V/V/V)；分离管柱的转速为正向洗脱700RPM；分离温度为45℃且流动相流速为2.0ml/min。
关键词高速逆流色谱(HSCCC)；石杉碱甲；千层塔（蛇足石杉）；植物单体制备高速逆流色谱（High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC）技术是一种较为新型的无固体支撑的液－液分配色谱技术，由美国国立健康研究院（National Institute of Health，U.S.A）Ito博士最先研制开发。
它利用螺旋管分离柱在做行星式运动时形成的单向性流体动力平衡体系，使得互不混溶的两相溶剂不断混合，同时保留其中的一相作为色谱分离的固定相，而另一相在恒流泵的作用下连续输入作为色谱分离的流动相，从而在螺旋管柱内形成固定相与流动相连续的两相分割与对流趋势，实现连续、高效的液－液分配过程[1]。
目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[2]。
90年代以来，高速逆流色谱技术被广泛地应用于天然药物成分的分离制备与分析鉴定中[3]。
石杉碱甲是从中国特有植物千层塔（蛇足石杉）中提取的一种生物碱，是中国独创的一种世界级新药。
属于可逆性胆碱酯酶抑制剂，是目前治疗良性记忆障碍和早老性痴呆症最为安全有效的药物之一[4,5]。
石杉碱甲单体在千层塔植物干燥全草中的含量约为0.02%，且常伴有成分复杂、结构相似的共生生物碱，应用常规的分离方法难以大量获得[6]。
目前采用的生产方法为溶剂法，产品得率低，生产周期长[7~11]。
有机合成石杉碱甲由于技术问题，目前尚未获得突破[12,13]。
我们利用现代高新分离技术——高速逆流色谱，以千层塔植物提取物为原料，对石杉碱甲单体的制备进行研究，获得重大突破，取得一种分离周期短、产品纯度高、分离量大且分离过程稳定的工艺路线。
本论文将对这一研究成果作一简要的介绍，而与本课题相关的分项研究，如高速逆流色谱溶剂体系的选择、分离样品的预处理、高速逆流色谱主要工艺参数（温度[14]、转速及流速）的优化及工艺的产业化拓展研究（上样量及两相溶剂体系的单独配制）等将在其它论文中陆续发表。
1．仪器及试剂本论文的研究工作所应用的仪器设备均为华南理工大学与广州普源生化科技有限公司合作组建的华工－普源天然产物分离纯化技术开发中心所配备的实验仪器，主要为：高速逆流色谱系统：TBE300A高速逆流色谱主机＋AKTA Prime系统（主要含泵、检测器及收集器等）＋MultiTempⅢ（恒温水浴）＋Prime View 2.0（色谱工作站），上海同田生化技术有限公司＋Amersham Pharmacia Biotech；高效液相色谱系统：HP1100 ＋HP ChemStation，HP Corporation；千层塔植物提取物：约5%石杉碱甲含量，宁波立华制药有限公司；石杉碱甲对照品：99.1%石杉碱甲含量，宁波立华制药有限公司；n-Hexane：分析纯，天津市津沽工商实业公司；n-BuOH：分析纯，天津市化学试剂一厂；Methanol：HPLC色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司；Triethanolamine：分析纯，天津市博迪化工有限公司；双蒸水及反渗透水：均为自制获得。
2．高速逆流色谱分离实验2.1 实验步骤取n-Hexane、n-BuOH及H2O按4：1：5的比例配制约2000ml的两相溶剂体系，并于室温下平衡过夜；根据石杉碱甲的结构特性，利用一定的方法把千层塔植物提取物处理成石杉总碱；取少量石杉总碱用高速逆流色谱溶剂体系配制样品溶液；按如下2.2的工作流程进行高速逆流色谱分离实验。
2.2 工作流程图1 高速逆流色谱实验的工作流程图1表示出了本研究工作所采用的高速逆流色谱系统的工作流程。
实验过程中，溶剂在泵的作用下经过六通上样阀，按一定的通路，进入水平行星式高速旋转的螺旋管分离柱中，样品在其中进行分配分离，流分通过紫外检测器等进行检测，并通过分布收集器收集，实验过程的参数及实验结果通过色谱工作站监控并记录。
本论文的研究工作根据选定溶剂体系的特性，首先采用正向洗脱方式把目图2 石杉总碱在选定条件下的HSCCC分离谱图3. 分离结果的高效液相色谱分析测试图2中第3部位流份经高效液相色谱分析，其结果如图3-a所示。
另外往这一流份中加入少量的石杉碱甲对照品在同样的色谱条件下进行高效液相色谱分析，其结果如图3-b所示。
分析所用的色谱条件为：色谱柱（Hypersil ODS 5μm，4.6*250mm，Agilent）；流动相（Methanol/H2O/Triethanolamine=60:40:0.02, V/V/V）；流动相流速（1.0ml/min）；柱温（40.0℃）；紫外检测波长（310nm）；样品溶媒（HPLC流动相）；样品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤。
a ）第3部位流份的HPLC 色谱图b ）第3部位流份稀释液＋石杉碱甲对照品叠加的HPLC 色谱图图3 图2中石杉碱甲流份的确定以上的分析结果说明图2中对应的第3部位流份的主成分为石杉碱甲，且其在相应的HPLC 色谱条件下，除主成分峰外在20min 内未显示出杂质峰并与对照品在相同的色谱条件下具有相同的高效液相色谱峰特性。
另外经过对照品外标法定量测定，本研究成果所得的石杉碱甲产品纯度高于98%且高速逆流色谱工艺的目标成分回收率为81.3%。
4. 结论利用选定的溶剂体系——n-Hexane/n-BuOH/H 2O （4：1：5）及优化后的高速逆流色谱工艺参数（700RPM 正向洗脱、2ml/min 及45℃），在分析与半制备型高速逆流色谱仪上，从千层塔植物提取物中分离制备获得了石杉碱甲单体。
工艺的分离周期较短、产品纯度高、分离量较大，而且经实验验证工艺的稳定性较高。
参考文献[1] Ito Y.J. Chromatogr. 1981, 207:161~170.[2] Yuan Liming （袁黎明），Fu Ruonong （傅若农），Zhang Tianyou （张天佑）. Chinese J.Pharm. Anal. （药物分析杂志），1998，18（1）：60～653．[3] Zhang Tianyou(张天佑). The Technology of Countercurrent Chromatography(逆流色谱技术). Beijing(北京); Science and Technology Press of Beijing(北京科学技术出版社), 1991.[4] Ashani Y, Peggins JO, Doctor BP. Mechanism of inhibition of cholinesterases byhuperzine A[J]. Bio Chem Bio Phys Res Comm, 1992, 184(2): 719~726.[5] Saxena A, Qian-N, Kovach-I-M, Kozikowski-A-P, et al. Identification of aminoacid residues involved in the binding of Huperzine A to cholinesterases[J].Protein Sci, 1994, 3(10): 1770~1778.[6] 孙远明，余红英，杨跃生，张明. HPLC 法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量. 中草药. 2002,33(12): 1078~1080.[7] 袁珊琴，冯锐，顾国明. 蛇足石杉生物碱成分的研究（Ⅱ）[J]. 中草药，1994，25（9）：453～454.[8] Liu JS, Zhu YL, Chao MY, et al. The structures of huperzine A and B, two newalkaloids exhibiting marked anticholiesterase activity [J]. CAN. J. CHEM, 1986, 64:837~839.[9] 刘嘉森，俞超美，周有作，等. 石杉碱甲和石杉碱乙的化学研究[J]. 化学学报，1986，44：1035～1040.[10] 沈生荣，于海宁，金超芳，徐月荣. 石杉碱甲提取工艺研究. 浙江大学学报. 2002,28(6):591~595.[11] 张秀尧，王惠康，齐一萍. 蛇足草（千层塔）的化学成分研究[J]. 中草药. 1990，21（4）：2～4.[12] Campiani Giuseppe, kozikowski Alan P, Wang SM. et al. Synthesis andanticholinesterase activity of huperzine A analogues containing phenol and catechol replacements for the pyridine ring[J], Bioorganic- and- Medicinal- Chemistry- Letters, 1998, 8(11):1413~1418.[13] Kaneko S, Nakajijm aN, Shikano M. et al. Synthetic studies of huperzine A andits fluorinated analogues. 2. Synthesis and acetycholinesterase inhibitory activity of novel fluorinated huperzine A analogues [J]. Tetrahedron, 1998, 54(21):5485~5506.[14] 陈建华，黄少烈，张扬，梁成满.高速逆流色剖技术制备石杉碱甲单体的工艺参数研究及讨论（Ⅰ）——温度.中国现代应用药学. 2004，07.Prepare Huperzine A by High-speed CountercurrentChromatographyChen Jianhua, Huang Shaolie, Zhu Baozhang, Liu HuifaSCUT－Puyuan Natural Product Separation & Purification Technology R&D Center School of Chemical Engineering & Energy SourcesSouth China University of TechnologyGuangzhou, 510640, P.R.CHINAAbstract Eight component parts have been obtained at one time from herb extract of Qian Ceng Ta by High-speed Countercurrent Chromatography Technology in six hours. One of these component parts has been ascertained to be Huperzine A by HPLC and its monomer purity is higher than 98%. The selected technologic parameters of this method are n-Hexane/n-BuOH/H2O(4:1:5,V/V/V) for solvent system, 700RPM for clockwise separation column revolution speed, 45℃ for separation temperature and 2.0ml/min for flow rate of mobile phase.Key Words High-speed Countercurrent Chromatography (HSCCC); Huperzine A; Qian Ceng Ta (Huperzia serrata Thunb.(Trev.); Prepare monomer from Natural Herb。
