人单核细胞原代培养实验技术(供参考)

实验十一细胞的原代培养一、实验目的1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。

2、掌握无菌操作方法及注意事项。

3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。

二、实验原理模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。

三、实验器材1、纯水设备：纯水仪2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 m滤膜；3、超净工作台4、培养设备：普通培养箱、CO2培养箱；5、贮存设备：冰箱、液氮罐6、观察设备：倒置显微镜7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等培养主要用品1、培养瓶、皿：以玻璃器皿为主，应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品（1）培养瓶（2）培养皿2、血球计数板3、眼科剪、镊；实验材料7－14日龄鸡胚（肝素）抗凝血原代培养材料选择幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养分化程度低的组织比分化高的容易培养肿瘤组织比正常组织容易培养。

实验试剂1、D’Hanks液KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌。

4℃下保存。

2、o．25％胰蛋白酶（D’Hanks液配）3、M199 培养液4、小牛血清5、青、链霉素6、5％NaHCO3、2％碘酒7、75％酒精8、洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成四、实验方法与步骤一）培养前的准备工作1、用品清洗与消毒2、溶液配制与消毒（1）培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒（2）平衡盐等高压蒸汽消毒3、预热溶液4、工作间及超净台消毒：紫外线、消毒液。

5、洗手和着装6、进入无菌室7、关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)将消毒过的所用物品放入超净工作台中组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤1、配M199完全培养液：M199基础培养液90％小牛血清10％青霉素100IU/ml链霉素100 g/ml过滤除菌。

细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。

由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。

同时也为以后传代培养创造条件。

原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。

用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。

用吸管吸去上清液。

将组织块贴于培养瓶进行培养。

b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。

370C磁棒搅拌消化20－30分钟。

然后终止消化。

用几层无菌纱布过滤。

取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。

弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。

【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。

(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。

4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。

【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。

培育技术中人工单克隆细胞系建立的实验步骤随着科技的不断发展，人类对于生命的探索也进入了一个新的阶段。

在生命科学领域，人工单克隆细胞系的建立成为了一项非常重要的研究课题。

本文将介绍培育技术中人工单克隆细胞系建立的实验步骤。

首先，为了成功建立人工单克隆细胞系，我们需要选择一种合适的细胞作为起始材料。

一般情况下，常用的细胞包括人类胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞等。

这些细胞具有高再生能力和自我更新能力，非常适合进行细胞克隆实验。

此外，为了提高实验的成功率，我们需要使用健康的细胞，避免使用受污染或异常细胞。

接下来，我们需要准备培养基。

培养基是细胞生长和分裂所必需的营养物质和环境条件的综合体。

常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640等。

我们可以选择合适的培养基根据实验的需要进行配制。

在培养基准备好之后，我们需要进行细胞培养。

首先，将细胞分散在培养基中，并将其转移到一个含有适量培养基的组织培养皿中。

然后，将培养皿放入恒温培养箱中，保持适当的温度和湿度，以确保细胞的正常生长。

此外，添加适当的培养条件也是非常重要的，如增加适量的二氧化碳和提供充足的营养物等。

当细胞达到一定的密度后，我们需要进行细胞的分离和筛选。

细胞分离可以通过不同的方法实现，常见的包括限稀稀释法、玻璃管吸取法等。

选择合适的方法可以帮助我们获得纯净的细胞群落。

筛选则需要根据实验的目的，选择适当的标记物或标记方法，如GFP等。

接下来，我们需要进行单克隆培养。

单克隆培养是将分离好的细胞种植于含有培养基的单个细胞培养皿中，使其独立生长并形成单个的细胞克隆。

这个过程需要耐心和仔细的操作，以防止不同细胞的相互干扰和混合。

在单克隆培养的过程中，我们需要进行观察和记录。

观察细胞的生长状态、形态和倍增时间等指标，以判断细胞克隆的质量和稳定性。

同时，进行记录可以帮助我们更好地理解细胞的生理过程和特性。

最后，我们需要进行细胞系的鉴定和验证。

通过比较新建立的细胞系与其他已知细胞系的特性，可以确认其身份和纯度。

一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。

3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。

二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。

原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。

2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。

3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。

4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。

四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。

（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。

（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。

（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。

2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。

（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。

3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。

（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。

（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。

4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。

（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。

五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。

2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。

3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。

六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。

应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。

2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。

应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。

1.单个核细胞分离
1.采集静脉血用EDTA-K2抗凝管无菌采集静脉血2ml，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。

2.稀释抗凝血用无菌吸管加入2ml等体积的Hanks液或磷酸缓冲盐溶液PBS 充分，使血液等倍稀释，降低红细胞的凝集，提高分离效果。

（此步骤可省去）
3.分离PBMC
（1）取淋巴细胞分离液3ml于灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45度，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意勿使血液混入淋巴细胞分离液中。

（2）平衡后，于离心机中室温2000r/min离心20分钟。

离心后，最上层为血浆层，第二层即为单个核细胞层。

（3）用毛细吸管吸取最上层的血浆、血小板后弃去。

再用另一毛细血管吸取单个核细胞于新的无菌离心管中。

4.洗涤PBMC预估转移的单个核细胞的体积，加入3~5倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。

之后去掉上清，继续加入3~5倍的平衡盐溶液，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min 离心10分钟，去上清后备用。

细胞原代培养实验报告一、实验目的本实验旨在通过细胞原代培养实验，学习细胞培养技术，了解细胞生长特性和生理功能，以及评估细胞毒性和细胞增殖能力。

二、实验原理细胞原代培养是指从组织或器官中分离出的一种或多种类型的原代细胞在无血清条件下进行传代培养。

该技术可以用于研究不同类型的细胞生长特性、生理功能和分子机制。

在无血清条件下进行原代细胞培养可以避免血清成分对实验结果的影响，并且有助于减少非特异性因素对实验结果的干扰。

三、实验步骤1. 准备工作：将所需物品（包括培养皿、离心管、移液器、显微镜等）消毒，并将所有物品放置在无菌条件下。

2. 组织取样：选择需要研究的组织或器官，如肝脏、肺组织等，并将其切成小块。

3. 组织分离：将组织块放入含有酶类消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，将其放置在37℃的恒温培养箱中进行消化。

消化时间根据不同的组织类型而异，通常需要30分钟至1小时。

4. 细胞分离：将消化后的组织过筛，用离心管收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤。

5. 细胞培养：将细胞沉淀转移至含有完整培养基（如DMEM/F12）的无菌培养皿中，并加入适量的血清替代物（如B27），以促进细胞生长和增殖。

将培养皿放置在37℃、5% CO2、95%湿度的恒温培养箱中进行传代培养。

6. 细胞检测：通过显微镜观察细胞形态和数量变化，并使用MTT法或CCK-8法评估细胞增殖能力。

同时可以使用流式细胞术等技术对细胞进行表型和功能分析。

四、实验结果通过原代细胞培养实验，我们成功地从肺组织中分离出了一种类型的原代肺成纤维细胞（primary lung fibroblasts）。

在无血清条件下进行传代培养后，我们观察到细胞数量逐渐增加，并且细胞形态发生了明显的变化。

同时，我们使用MTT法评估了细胞增殖能力，并发现细胞在培养24小时后开始快速增殖，直到培养72小时时达到峰值。

此外，我们还使用流式细胞术对原代肺成纤维细胞进行了表型和功能分析，并发现其具有一定的合成和分泌基质蛋白的能力。

细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。

由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。

同时也为以后传代培养创造条件。

原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。

用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。

用吸管吸去上清液。

将组织块贴于培养瓶进行培养。

2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。

370C磁棒搅拌消化20－30分钟。

然后终止消化。

用几层无菌纱布过滤。

取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。

弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。

取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。

取材应严格无菌。

取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。

取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。

二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。

动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。

放入孵化箱中孵养待用。

2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。

细胞攻略 | THP-1(人单核细胞白血病细胞)细胞培养教程细胞基本信息▲细胞正常生长形态照片细胞名称：THP-1(人单核细胞白血病细胞)细胞别称：THP1; THP 1; THPI; THP-1(ATCC); Tohoku Hospital Pediatrics-1细胞货号: SNL-044生长特性: 悬浮培养条件: 1640+10%FBS+0.05mM β-mercaptoethanol+1% P/S培养环境:空气，95%；二氧化碳 (CO2)，5%细胞简介：THP-1细胞从一名1岁的患有急性单核细胞性白血病的男孩的外周血中分离建立，细胞可以吞噬乳胶颗粒和激活的红细胞，细胞膜和胞浆内均没有免疫球蛋白，表达C3R和FcR。

THP-1细胞可受佛波酯、TPA诱导向单核系方向分化。

THP-1细胞可以用于3D细胞培养、免疫系统紊乱、免疫学和毒理学研究，也是一种合适的转染宿主。

THP-1细胞培养注意事项THP-1细胞悬浮圆形生长，偶有小聚团，属于正常现象，无需吹散；圆形透亮、细胞膜完整的细胞是活细胞，如果无法判断，可以取少量细胞用台盼蓝染色后计数确定细胞活率；少量细胞附着瓶底属于正常现象，可将悬浮细胞转移至新瓶，丢弃贴壁的细胞；THP-1喜欢偏酸环境，培养基呈橘色时可不用换液，补充适量新鲜培养基维持一天再进行换液或传代操作；THP-1有密度依赖性，密度低时生长较慢，培养密度维持在30万-100万细胞/mL之间为宜，超过80万细胞/mL即可传代；THP-1复苏后恢复较慢，如无特殊情况，复苏后48小时内不对细胞进行操作；THP-1生长需要稳定的环境，不频繁拿出培养箱，不频繁离心；培养时瓶子竖立放置（瓶盖朝上），可增加细胞局部密度，促进细胞增殖。

β-巯基乙醇可以消除活性氧自由基，维持细胞高密度生长。

若培养基中不添加β-巯基乙醇，长期培养细胞可能会出现大量贴壁，严重聚团等情况。

THP-1 细胞换液方法离心换液法：1. 准备所需的培养基、离心管以及无菌枪头等；（培养基提前预热）2. 将所有细胞悬液转移至离心管中；3. 900-1000rpm，3min离心；4. 弃上清，加5mL PBS轻轻重悬细胞进行润洗，再900-1000rpm，3min离心；Tips：此处PBS润洗是为了去除细胞碎片，平时培养若细胞碎片不多可以忽略此步骤，若碎片偏多，可以重复润洗2次。

人单核细胞白血病（THP-1）细胞培养方法THP-1细胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。

它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液，有分化为多种巨噬细胞的能力，是各领域研究常用的细胞系之一。

THP-1是人外周血的单核细胞系，最初来源于急性单核细胞性白血病患者。

属于悬浮细胞，适合用于转染或感染实验。

其表面抗原HLA型为：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。

细胞复苏细胞复苏步骤1. 预热水浴锅至37℃2. 准备一个15mL离心管，加入2-3mL左右完全培养基待用3. 将细胞从-80℃冰箱或液氮中取出后，放进一次性PE手套中，立即投入水浴锅，迅速用力摇晃管子，使其1分钟内融化4. 酒精擦拭冻存管，进入生物安全柜，把融化的细胞悬液缓慢滴加到步骤2准备好的离心管中5. 1200rpm（约250g）离心3分钟6. 同时准备1个新的T25培养瓶，加入5mL完全培养基7. 去上清，新鲜培养基重悬细胞后滴加到步骤6的培养瓶里，放入培养箱小贴士：THP-1细胞复苏后通常需要3-5天恢复状态，建议复苏后48小时内不要进行操作。

细胞冻存细胞冻存步骤1. 预先配制好冻存液2. 细胞1200rpm（约250g）3分钟离心后3. 去上清，用配好的冻存液重悬细胞4. 转移入冻存管5. 冻存管放进程序冻存盒6. 冻存盒放进-80度冰箱过夜，再放液氮长期保存小贴士：由于THP-1是悬浮细胞，更易受到冻存影响，建议加大冻存密度，大约200万-300万/mL为宜，以提高复苏存活率。

细胞培养条件培养基：RPMI-1640+10%FBS+0.05 mM β-mercaptoethanol+1%P/S推荐传代比例：1:3-1:6，每2-3天换液一次培养条件：气相：95%空气+5%二氧化碳，温度：37℃传代操作当细胞密度达到约8x10^5cells/ml左右时，即可进行传代。

由于是悬浮细胞，可直接将细胞吸出，离心之后传代。

原代细胞培养之－－细胞分离技术原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。

二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。

（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。

此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。

此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（1）胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。