甲型肝炎病毒检测方法研究进展

甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检测方法的研究及应用发表时间：2017-06-12T10:03:18.517Z 来源：《中国误诊学杂志》2017年第6期作者：张龙丰张玲珠[导读] 建立甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检测方法。

1.牡丹江市第一人民医院 157011；2.黑龙江省林业职业技术学校 157011 摘要：目的：建立甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检测方法。

方法：用双抗体夹心ELISA法检测试剂对甲型肝炎灭活疫苗及效力试验参比进行检测，以检测OD值为反应指标，用生物检定双平行线法的基本原理进行统计分析，计算待检疫苗对应于效力参比品的相对效力（R 值）。

结果：样品HAAg含量与检测OD值之间具有高度的相关性，验证了4个指标全部通过了验证；用所建立的体外相对效力试验检测法对32批次甲肝灭活疫苗进行检测，结果与小鼠体内效力检测结果具有良好一致性，均能反映疫苗相对效力，两种方法检测相对效力（R值）之间无明显差别。

结论：所建立的甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力试验是一种灵敏、特异、方便、快捷的效力测定方法，可应用于甲型肝炎灭活疫苗效力检测。

关键词：甲型肝炎灭活疫苗效力；抗原检测；研究及应用Abstract：Objective：to establish a method to determine the relative potency of Inactivated Hepatitis A Vaccine in vitro. Methods：the method of double antibody sandwich ELISA kit to test Inactivated Hepatitis A Vaccine and the effect of reference for testing，to detect the OD value of reaction index，the basic principle of biological verification of parallel method for statistical analysis，the calculation to be detected corresponding to the relative effectiveness of vaccine effectiveness than ginseng the product（R）. Results：with a high degree of correlation between the HAAg content of the sample and detection OD，verified the 4 indicators all through the verification；with the established in vitro relative potency test detection method for 32 batches of inactivated hepatitis A vaccine was detected in mice results and potency testing results have good consistency，are can reflect the relative effectiveness of the vaccine，two methods for the detection of the relative potency（R）. conclusion：no obvious difference between Inactivated Hepatitis A Vaccine established in vitro The relative potency test is a sensitive，specific，convenient and rapid method for the determination of potency in Inactivated Hepatitis A VaccineKeywords：Inactivated Hepatitis A Vaccine effect；antigen detection；research and Application灭活疫苗动物体内效力检测周期一般均较长，且结果受多种因素的影响，所以WHO及国际生物制品标准化协会推荐尽量不用动物法进行生物制品质量检定。

不同方法检测甲型肝炎病毒 IgM抗体摘要：目的通过不同方法学检测甲型肝炎IgM抗体，总结一种提高特异性和敏感性，减少临床误诊和漏诊，便于推广普及，便于标准化管理和提高工作效率的方法。

方法甲型肝炎IgM抗体首先用化学发光法初筛，阳性标本再用胶体金法和酶联免疫法进行复检。

结果 2021年01月～2022年02月期间，在我院体检科办理健康证体检人群27463例，用化学发光法检测甲型肝炎IgM抗体初筛阳性15例；15例阳性标本再用酶联免疫法进行复测，结果酶联免疫法检测阳性4例。

结论化学发光法便于标准化操作和提高工作效率，也是未来发展方向，用化学发光法初筛，阳性标本再用酶联免疫法进行复测验证，可解决化学发光敏感性过高的问题，能更好的保证检测结果质量，减少误诊和漏诊。

关键词：甲型肝炎IgM抗体；化学发光法；酶联免疫法。

甲型病毒性肝炎简称甲肝,是由甲型肝炎病毒(HepatitisA Virus,HAV)引起的一种急性传染病,甲肝IgM(HAV-IgM)抗体检测是甲肝的诊断标准之一。

甲型肝炎在临床上为一种常见的急性传染病。

病原体主要为甲型肝炎病毒，感染形式主要为流行和散发等[1]。

在我国近些年来甲型肝炎病毒导致的流行相对较少，然而在临床上仍有甲型肝炎散发；此类疾病已经成为公共卫生问题。

在临床诊断中甲型肝炎IgM为早期特异性指标。

甲型肝炎病毒通过粪便排出体外，可对海产品、食物、水源等进行污染，会造成大流行或散发[2]。

与乙型肝炎病毒相比，甲型肝炎病毒具有较长的持续时间，一般不会由于注射和输血而传播。

甲型肝炎病毒属小核糖核酸病毒科，肝病毒属；只有一种血清型，7种基因型；对热、酸、干燥有抵抗性，是肝炎病毒中惟一能用细胞培养的一种。

经粪-口途径传播，潜伏期3～9周。

甲型肝炎儿童多见，黄疸型多见，经济不发达卫生条件差的地区多见；可散发或暴发流行。

甲型肝炎是一种自限性疾病，经常为亚临床状态，尤其是儿童，80%～90%为隐匿性感染，无明显临床症状[3]。

浅谈感染性疾病甲肝、戊肝的免疫学检验效果摘要：目的运用不同免疫学检验方法对感染性疾病甲肝及戊肝进行检查，并对其检验效果进行深入分析。

方法将本县疾控中心于2021年3-6月常规监测人群中的60例甲肝、戊肝标本作为研究对象，甲肝患者为参照组，戊肝患者为试验组，两组均进行酶联免疫法及化学发光法进行检测，并对两种检测方式的结果及灵敏性、特异性进行对比。

结果通过研究发现，参照组酶联免疫法检出率为73.33%,化学发光法检出率为90%，试验组中酶联免疫法检出率为80%，化学发光法检出率为96.67%，经对比两种检测方式准确性差异较为显著，为此具备统计学意义。

另外，参照组灵敏性及特异性依次为90%、93.33%，试验组分别为93.33%及96.67%，两种检测方式差异不明显，为此不具备统计学意义。

结论通过对感染性疾病甲肝及戊肝进行免疫学检验发现，化学发光法检验效果更加明显，有着较高准确性，具备较高推广和应用价值。

关键词：感染性疾病；甲肝；戊肝；免疫学检验引言临床中，甲肝及戊肝都是病毒感染引起的，且两种疾病均属于传染性肝炎疾病范围，通过对相关资料进行整理发现，我国家甲肝及戊肝患者数量大幅度增加，加大肝炎病毒的控制力度成为当前亟待解决的问题，其中免疫学检验可以快速、准确诊断出患者肝炎类型，为此，在甲肝及戊肝临床治疗过程中，免疫学检验发挥了重要作用。

1.研究对象与方法1.1研究对象将本县疾控中心于2021年3-6月常规监测人群中的60例甲肝、戊肝标本作为研究对象，甲肝患者30例划分为参照组，戊肝患者30例划分为试验组，其中男性患者38例，女性患者22例。

1.2方法两组患者血液标本均进行酶联免疫法以及化学发光法检验，其中酶联免疫法检查时按照试剂说明书严格操作进行双抗原夹心酶联免疫以及间接酶联免疫检测。

磁微粒化学发光法通过化学发光对患者血清当中存在的戊型肝炎病毒特异性免疫球蛋白M抗体进行检测，该种检测方法运用捕获法原理，促进人免疫球蛋白M抗体包被磁微粒，其中所产生的辣根过氧化酶则会发挥标记作用，对患者血清中的HEV抗原制备酶结合物予以标记，进而产生免疫反应，促进固相二抗-抗体-酶标抗原复合物产生，上述这种复合物是在发光底物放出光子所具备的、所催化作用下产生的，其发光强度与HEV-IgM抗体的含量呈正比例关系[1]。

两种国产甲型肝炎病毒抗体（抗HAV-IgM）诊断试剂检测隐性甲肝患者血清结果的比较摘要】目的：探究两种国产甲型肝炎病毒抗体诊断试剂检测隐性甲肝患者血清结果比较，以供参考。

方法：选取2014年1月～2015年1月我中心32份甲肝阳性血清标本以1:1000稀释后，采用北京万泰抗HAV-IgM诊断试剂盒作为A试剂复查3孔，北京现代抗HAV-lgM诊断试剂盒作为B试剂复查3孔，探究其检查结果。

结果：研究可以看出，B试剂检出率与A试剂比较差异不明显，P＞0.05，差异无统计学意义。

结论：A、B试剂诊断隐性甲肝患者血清结果准确率均较高，有较高灵敏性及特异性，适用于甲型肝炎病毒抗体（抗HAV-IgM）诊断，具有较高临床诊断意义，值得推广。

【关键词】国产甲型肝炎病毒抗体；诊断试剂；检测；隐性甲肝患者血清【中图分类号】R575.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）09-0203-02甲型肝炎是世界范围内流行的一种传染性疾病，其临床症状一般为发热、腹痛、厌食等，主要通过粪口传播[1]，甲型肝炎分布状态比较散，各个地区都存在，严重影响患者生活质量。

本文研究中主要对32份被稀释过的甲肝阳性血清标本进行诊断检测。

1.资料和方法1.1 资料选取2014年1月～2015年1月我中心32份甲肝阳性血清标本以1:1000稀释后，采用北京万泰抗HAV-IgM诊断试剂盒作为A试剂复查3孔，北京现代抗HAV-lgM诊断试剂盒作为B试剂复查3孔。

32份标本均分别使用A、B两种试剂进行检测。

1.2 检查方法对32份初筛阳性血清标本以1:1000稀释后使用A试剂以及B试剂进行HAV-lgM抗体检测，采用自动酶免仪[2]进行检测，统计检测结果并对其进行有效分析。

1.3 观察指标观察A试剂以及B试剂的实验结果，即阳性以及阴性检出例数的差异性。

1.4 统计学处理本文数据均采用SPSS17.0软件进行统计学处理，当P>0.05的时候，则表示差异不具有统计学意义。

甲型肝炎疫苗的研发历程与成果展示甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性传染病，主要通过粪-口途径传播。

该病毒感染后可导致肝脏炎症和功能异常，严重时可引发肝硬化、肝癌等严重并发症。

为了预防和控制甲型肝炎的传播，科学家们经过多年的努力，成功地研发出了甲型肝炎疫苗。

甲型肝炎疫苗的研发历程可以追溯到20世纪50年代。

当时，科学家们首次成功地分离出甲型肝炎病毒，并开始研究其病毒学和免疫学特性。

随着对病毒的深入了解，科学家们开始尝试研发相应的疫苗。

在20世纪70年代，研究人员利用感染甲型肝炎病毒的志愿者进行了一系列的实验。

通过观察志愿者的免疫反应和疾病发展情况，科学家们逐渐确定了甲型肝炎病毒的抗原特性，并开始尝试提取和纯化这些抗原。

随着生物技术的发展，研究人员开始利用基因工程技术来生产甲型肝炎疫苗。

他们将甲型肝炎病毒的表面抗原基因克隆到大肠杆菌等宿主细胞中，通过大规模培养和纯化，获得了高纯度的抗原蛋白。

这些抗原蛋白被称为“乙型肝炎病毒表面抗原”（HBsAg），是甲型肝炎疫苗的主要成分。

甲型肝炎疫苗的临床试验于20世纪80年代开始。

在大规模的临床试验中，研究人员对数以千计的志愿者接种甲型肝炎疫苗，并观察其免疫反应和保护效果。

结果显示，甲型肝炎疫苗能够有效地诱导人体产生抗体，提供长期的免疫保护。

在甲型肝炎疫苗的研发过程中，科学家们还面临着一些挑战。

由于甲型肝炎病毒的传播途径特殊，疫苗的稳定性和安全性是研发过程中需要重点考虑的问题。

研究人员通过不断优化疫苗的配方和生产工艺，确保了疫苗的质量和安全性。

甲型肝炎疫苗的研发成果展示在全球范围内取得了巨大的成功。

根据世界卫生组织的数据，自从甲型肝炎疫苗问世以来，全球范围内的甲型肝炎发病率显著下降。

疫苗的广泛接种不仅减少了甲型肝炎的发病率，还降低了甲型肝炎相关的死亡率和并发症发生率。

然而，尽管甲型肝炎疫苗已经取得了巨大的成功，但在一些贫困地区和发展中国家，疫苗的普及和接种率仍然面临挑战。

甲肝和乙肝病毒及诊断试剂研究的发展史及临床应用□卫生部临床检验中心张瑞李金明李金明,医学博士，研究员。

卫生部临床检验中心临床免疫室主任。

中国医学科学院北京协和医学院和北京大学医学部博士研究生导师，享受国务院政府特殊津贴。

以项目和分课题负责人承担多项国家和国际合作研究课题。

学术兼职：国际临床化学协会（IFCC）分子诊断委员会委员、卫生部临床检验标准化委员会委员等。

医学参考报检验医学频道和分子诊断与治疗杂志副主编；中华检验医学杂志、中国输血杂志等多个杂志编委；。

在国内外学术期刊上以第一作者和通讯作者发表论文百余篇，其中SCI论文15篇。

编著、主编及参与多篇专著。

多次获北京市科技奖和中华医学科技奖叁等奖。

一、甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）（一）病原学HAV为微小RNA病毒科（Picornaviridae）中的嗜肝RNA病毒属（Heparnavirus），该属仅有HAV一个种。

HAV呈球形，直径27-32nm，无包膜，由32个亚单位结构组成20面对称体颗粒。

电镜下见实心和空心两种颗粒，实心颗粒为完整的HAV，有传染性；空心颗粒为未成熟的不含RNA的颗粒，具有抗原性，但无传染性。

HAV基因组为单股线状RNA，全长由7478个核苷酸组成。

HAV对外界抵抗力较强，耐酸碱，室温下可生存1周，干粪中25℃能生存30天。

HAV主要由粪-口途径传播。

（二）病原学检查及临床意义由于无论从临床表现还是从肝功能检查，都无法将急性甲型肝炎病毒感染与其他类型的肝炎病毒感染相鉴别，因此病原学检查对于诊断急性甲型肝炎病毒感染十分重要。

甲型肝炎的病原学检查包括：1. 抗HAV IgM: HAV感染后早期产生IgM型抗体，是新近感染的证据，是早期诊断甲型肝炎最简便而可靠的血清学标志。

在发病后数天即可阳性，一般持续8-12周，少数可延续6个月。

临床上多采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。

2. 抗HAV IgG：出现稍晚，于2-3个月达到高峰，是过去感染的标志，可持续多年或终身。

甲型肝炎疫苗的研发与推广进展甲型肝炎是由甲型肝炎病毒（HAV）引起的一种急性传染病，主要通过食物、水源和接触传播。

甲型肝炎在全球范围内广泛存在，尤其是发展中国家。

根据世界卫生组织（WHO）的数据，每年约有数百万人感染甲型肝炎，其中数千人因此死亡。

因此，甲型肝炎疫苗的研发与推广对于全球公共卫生具有重要意义。

一、疫苗研发的历史与进展甲型肝炎疫苗的研发可以追溯到20世纪70年代。

最早的疫苗是使用灭活的甲型肝炎病毒制备而成，但其制备过程复杂、成本高昂，且存在一定的安全性风险。

随着科技的进步，研究人员逐渐开展了基因工程技术在甲型肝炎疫苗研发中的应用。

1986年，首个基因工程甲型肝炎疫苗上市，标志着甲型肝炎疫苗进入了新的发展阶段。

目前，已经有多种甲型肝炎疫苗在市场上得到广泛应用。

这些疫苗主要分为两类：灭活疫苗和重组疫苗。

灭活疫苗是使用灭活的甲型肝炎病毒制备而成，通过注射来诱导免疫反应。

重组疫苗则是利用基因工程技术将甲型肝炎病毒表面抗原基因导入其他病毒载体进行表达，以达到免疫目的。

二、疫苗推广的挑战与策略尽管甲型肝炎疫苗已经存在多年，但在一些发展中国家，尤其是贫困地区，疫苗接种率仍然较低。

这主要是由于多种因素的综合作用，包括经济因素、医疗资源不足、信息传播不畅等。

为了提高疫苗接种率，需要采取一系列的策略。

首先，加强宣传与教育。

通过广泛宣传甲型肝炎的危害性和疫苗的安全性与有效性，提高公众对疫苗的认识和接种意愿。

此外，还需要加强医务人员的培训，提高他们对甲型肝炎疫苗的了解，以便能够向患者提供准确的信息和建议。

其次，推动疫苗的可及性和可负担性。

在贫困地区，疫苗的价格往往是一个重要的限制因素。

政府和国际组织可以通过补贴疫苗价格、提供免费疫苗等方式，降低疫苗的经济负担，增加贫困地区居民的接种意愿。

最后，加强疫苗供应链管理。

确保疫苗的储存和运输条件符合标准，避免疫苗的损坏和过期。

此外，建立健全的疫苗接种记录系统，方便对疫苗接种情况进行监测和评估。

甲肝疾病研究报告疾病别名：甲型肝炎，甲型病毒性肝炎所属部位：腹部就诊科室：传染科,消化内科病症体征：肝肿大，疲乏，腹胀，食欲不振，肝区痛疾病介绍：甲肝是什么？甲型病毒性肝炎（简称甲肝）是由甲肝病毒（HAV）引起的一种病毒性肝炎，主要是经粪口传播途径感染，即由病人的潜伏期或急性期粪便，血液中的甲肝病毒污染水源，食物，用具及生活密切接触经口进入胃肠道而传播，甲肝病毒对各种外界因素有较强的抵抗力而能长期在外界环境中存活，能通过各种污染物品（手，日常用品，衣物，被单等）以及水和食物传播，也可经苍蝇携带而传播症状体征：甲肝有哪些症状？甲肝病情初发时，病人会出现疲乏无力、不想吃饭，小便颜色加深，有时伴有发烧等症状，严重时眼睛、皮肤发黄。

一旦出现上述症状，应立即到医院检查。

黄疸前期，急数患者有发热畏寒，体温在38～39℃之间。

平均热程3日，少数达5日，全身乏力、食欲不振、厌油、恶心、呕吐、上腹部饱胀感或轻度腹泻。

少数患者以上呼吸道感染症状为主要表现，尿色逐渐加深呈浓茶色。

本期持续5～7日。

黄疸期自觉症状好转，热退后黄疸出现，可见巩膜、皮肤不同程度黄染，肝区痛，肝脏肿大，有压痛和叩痛，部分患者有脾肿大。

本期可有短期大便颜色变浅，皮肤瘙痒。

肝功能明显异常。

持续2～6周。

暴发型甲型肝炎约占全部病例的0.1～0.8%，但病死率甚高，达50%。

本型起病甚急，可有发热、食欲不振、恶心、频繁呕吐、极度乏力等明显的消化道及全身中毒症状；黄疸逐渐加深，肝脏进行性缩小，有出血倾向，中毒性鼓肠，肝臭、腹水、急性肾功能衰竭和不同程度的肝性脑病表现，直至出现深度昏迷、抽搐。

患者多因脑水肿、脑疝、消化道出血、肝肾功能衰竭等死亡，病程不超过3周。

化验检查：甲肝要做什么检查？甲肝的检查1、肝功能检查：测定ALT有助于早期肝炎的诊断，谷丙转氨酶明显异常，血清胆红素>17MOL/L，尿胆红素阳性。

但ALT升高并无特异性，单项ALT较正常值升高2倍以上，排除其它原因，结合临床表现及其他相关检查才有诊断价值。

甲型肝炎疫苗的研发历程与改进方向甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性传染病，主要通过粪-口途径传播。

这种疾病在全球范围内广泛存在，尤其在发展中国家和一些资源匮乏地区，甲型肝炎的流行程度更高。

为了有效预防和控制甲型肝炎的传播，研发和改进甲型肝炎疫苗是至关重要的。

甲型肝炎疫苗的研发历程可以追溯到20世纪70年代。

最早的甲型肝炎疫苗是由人类血浆中提取的免疫球蛋白制备而成，但这种疫苗的供应量有限，且存在传染其他疾病的风险。

为了克服这些问题，科学家们开始寻找其他疫苗制备方法。

1980年代，研发出了第一种基因工程技术制备的甲型肝炎疫苗。

这种疫苗使用重组DNA技术将甲型肝炎病毒的表面抗原基因（HBsAg）导入酵母细胞进行表达，并通过纯化和灭活等步骤制备而成。

这种基因工程疫苗的问世，不仅解决了血浆疫苗供应不足的问题，还提高了疫苗的安全性和效果。

然而，尽管基因工程甲型肝炎疫苗取得了巨大成功，但其仍存在一些挑战和改进的方向。

首先，基因工程疫苗的生产成本较高，这使得在一些资源匮乏地区难以普及。

其次，疫苗的免疫效果在一些特殊人群中可能不如预期，例如免疫力低下的人群和老年人。

此外，疫苗的长期保护效果还需要进一步研究。

为了改进甲型肝炎疫苗，科学家们正在开展多个方面的研究。

一方面，他们正在寻求降低疫苗生产成本的方法，例如改进疫苗制备工艺、提高疫苗产量等。

这将有助于在资源匮乏地区推广和普及疫苗，从而更好地控制甲型肝炎的传播。

另一方面，科学家们也在努力改进疫苗的免疫效果。

他们正在研究疫苗的剂量和接种方案，以提高疫苗在特殊人群中的保护效果。

此外，他们还在探索其他免疫增强措施，例如联合疫苗接种、使用佐剂等。

此外，研究人员还在努力深入了解甲型肝炎病毒的传播途径和流行病学特征，以便更好地制定预防和控制策略。

他们通过监测和追踪病例，研究病毒的变异和演化规律，以及评估疫苗的实际效果，为改进甲型肝炎疫苗提供科学依据。

总之，甲型肝炎疫苗的研发历程经历了从血浆制备到基因工程技术制备的转变，取得了显著的成果。

荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测甲型肝炎病毒孙栋良,杨栋,金敏,周树青,姜瀚集,李君文*,尹静*(军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所,天津300050) 摘要:目的建立基于荧光重组酶聚合酶扩增(RPA )技术的甲型肝炎病毒快速检测方法㊂方法设计针对甲型肝炎病毒特异性保守序列的RPA 引物和探针,利用TwistAmp ®exo 检测试剂盒建立荧光RPA 扩增体系,对引物扩增效率㊁特异性㊁灵敏性进行评价㊂结果本研究通过设计甲型肝炎病毒异性片段的RPA 引物㊁探针,建立了基于荧光RPA 技术的甲型肝炎病毒快速检测方法㊂引物筛选实验表明,荧光RPA 反应4min 时即可检测到起峰的曲线,扩增的目的片段长度为200bp ㊂特异性实验结果表明:本研究建立的RPA 检测方法能够特异性地扩增甲型肝炎病毒基因组,不能扩增戊型肝炎病毒㊁诺如病毒㊁星状病毒基因组㊂灵敏性实验结果表明:本研究建立的RPA 检测方法能够检测到低至15.6copies /μL 的甲型肝炎病毒㊂结论本文建立的荧光RPA 检测方法特异性强㊁灵敏性高㊁稳定性好以及可操作性强,可用于对甲型肝炎病毒的检测㊂ 关键词:　甲型肝炎病毒;　重组酶聚合酶扩增;　快速检测 中图分类号:R512.6 文献标志码:A 文章编号:1001-5248(2020)10-0051-03基金项目: 十三五”国家重点研发计划课题(No.2017YFC1601204)作者简介:孙栋良(1989-),男,硕士研究生,从事食源性病毒富集与检测技术的研究㊂*通信作者E-mail:yjzhych @ 甲型肝炎是因感染甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)导致的传染性肝炎,是全球范围内重要的公共卫生问题之一〔1〕,2015年世界卫生组织(WHO)统计全球约有11000人死于甲型肝炎〔2〕㊂我国曾经是甲型肝炎流行大国,1988年上半年,上海市爆发大规模甲型肝炎流行,感染者达31万〔3〕㊂2008年国家将甲型肝炎疫苗纳入扩大计划免疫后,我国的甲型肝炎发病率已降至欧美等低流行国家的水平〔4〕㊂但由于甲型肝炎病毒具有较强的环境适应性,在低温下能够存活数月仍具有感染性〔5〕,较低的剂量即可感染人类(约10-100个病毒拷贝〔6〕),甲型肝炎病毒对公共卫生的威胁不容忽视㊂2020年3月,丹东和大连地区出现甲型肝炎散发病例,提示我们防控甲型肝炎防控工作任重而道远㊂因而建立快速㊁高效㊁特异的甲型肝炎病毒检测技术,对疫情的预防和控制具有重要意义㊂重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplifica⁃tion,RPA)是英国TwistDx Inc 公司研发的一种新型等温核酸扩增技术㊂它利用重组酶㊁DNA 聚合酶㊁单链结合蛋白,在37-42℃条件下即可扩增相应片段,5-20min 内即可快速扩增获得检验结果〔7〕㊂与聚合酶链式扩增反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相比,在灵敏性㊁特异性相当的情况下,RPA 为等温核酸扩增,对仪器设备要求不高,适宜应用于现场检测㊂RPA 技术已应用于新型冠状病毒〔8〕㊁登革热病毒㊁埃博拉病毒㊁禽流感病毒㊁寨卡病毒等病毒的检测㊂本研究基于荧光RPA 技术,建立快速㊁高特异性㊁高灵敏性检测甲型肝炎病毒的方法㊂1　材料与方法1.1　材料　甲型肝炎病毒㊁G Ⅱ.4型诺如病毒㊁戊型肝炎病毒㊁星状病毒保存于本实验室超低温冰箱㊂RPA 检测试剂盒(TwistAmp DNA Amplification exo Kits)购于英国TwistDX 公司,RNA 提取试剂盒(EZ-10柱式总RNA 抽提试剂盒)购于上海生工生物技术有限公司,cDNA 合成试剂盒(PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购于大连宝生物公司㊂1.2　方法1.2.1　引物设计　根据TwistAmp ®exo 试剂盒实验设计手册,RPA 引物长度通常为30-35bp,假如引物过短会影响重组酶的活性,目的扩增片段长度不宜超过500bp,以100-200bp 的扩增片段长度效果最佳㊂RPA 荧光探针由四氢呋喃(THF)㊁荧光基团㊁淬灭基团和3’端封闭物组成,探针长度为46-52bp,荧光基团㊁淬灭基团取代寡核苷酸的T 碱基㊂本研究以甲型肝炎病毒VPl /VP3同源序列对比分析,确定保守核心区域为靶标,使用Primer -Blast (https:// /tools /primer -blast /)设计引物,并根据扩增片段设计相应的荧光探针㊂引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成㊂序列如下:F1:5’-TATACAAAGTCAGCACATCAGAAAG⁃GTGAGTAC-3’,R1:5’-TCATCTCCAACTTGTGTAGTA⁃ACATCCATAGCATG-3’,F2:5’-CAGAGTGAACAGG⁃TATACAAAGTCAGCACATCA-3’,R2:5’-CAACTTGT⁃GTAGTAACATCCATAGCATGATAAAGA-3,P1:CTCCT⁃TCTAACGTTGCTTCCCATGTCAGAG/i6FAMdT/G/id⁃Sp/A/iTAMdT/GTTTATCTTTCAGCA/iSpC3/,P2:CGT⁃TGCTTCCCATGTCAGAGTGAATGTTTA/i6FAMdT/C/ idSp/T/iTAMdT/CAGCAATTAACTTG/iSpC3/㊂1.2.2　建立RPA反应体系　按照TwistAmp®exo 试剂盒的要求,反应总体系为50μL㊂首先配制反应混合液47.5μL,其中包含29.5μL Rehydration Buff⁃er㊁上㊁下游引物各2.1μL(10μmol/L)㊁荧光探针0.6μL(10μmol/L)㊁无酶水11.2μL㊁cDNA2μL㊂然后将上述反应混合液与冻干酶粉混匀㊂最后加入醋酸镁溶液(280mM)2.5μL㊂使用罗氏荧光检测仪(LightCycler480)检测荧光强度,反应温度为39℃,反应时间为30min㊂1.2.3　引物㊁探针筛选　以9.34×104copies/μL 甲型肝炎病毒cDNA为模板,利用合成的引物和探针交叉组合,进行8种组合搭配,使用罗氏荧光检测仪(LightCycler480)进行RPA扩增反应,以筛选引物和探针㊂1.2.4　特异性实验　以甲型肝炎病毒㊁戊型肝炎病毒㊁诺如病毒㊁星状病毒基因组为模板,使用罗氏荧光检测仪(LightCycler480),39℃恒温反应30min,检验所建立荧光RPA反应体系的特异性㊂1.2.5　灵敏性实验　将合成的含有甲型肝炎病毒靶标片段的pUC57标准质粒用去离子水分别稀释为1.56×105copies/μL㊁1.56×104copies/μL㊁1.56×103copies/μL㊁1.56×102copies/μL㊁1.56×101cop⁃ies/μL㊁1.56copies/μL,用上述稀释梯度的质粒标准品作为模板,进行荧光RPA反应,确定反应体系的灵敏性㊂1.2.6　实际样品检测　将甲型肝炎病毒加入毛蚶消化腺中,按照‘贝类中甲型肝炎病毒检测方法通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法(GB/T22287-2008)“〔9〕进行食品样品预处理㊁提RNA㊁逆转录等操作步骤,得到甲型肝炎病毒cDNA,分别用荧光PCR㊁荧光RPA方法检测,对比甲型肝炎病毒检出率㊂2　结果2.1　引物、探针筛选结果　引物㊁探针筛选结果如图1所示,F2-R2-P1组合在RPA反应4min时,即可检测到起峰,总荧光强度高于其它组合,目的片段长度为200bp㊂因此该组合性能较好,适用于检测甲型肝炎病毒基因组㊂2.2　特异性实验　分别将甲型肝炎病毒㊁戊型肝炎病毒㊁诺如病毒㊁星状病毒cDNA为模板,于39℃进行荧光RPA扩增反应30min,结果如图2所示㊂结果显示:F2-R2-P1组合可特异性扩增甲型肝炎病毒基因组,而无法扩增戊型肝炎病毒㊁诺如病毒㊁星状病毒基因组㊂因此,本研究建立的荧光PRA体系可用于特异性检测甲型肝炎病毒㊂2.3　灵敏性实验　将含有靶标片段的标准质粒用去离子水分别稀释为1.56×105copies/μL㊁1.56×104copies/μL㊁1.56×103copies/μL㊁1.56×102cop⁃ies/μL㊁1.56×101copies/μL㊁1.56copies/μL,用上述稀释梯度的质粒标准品作为模板,进行荧光RPA 反应,实验结果如图3㊂结果表明,本研究建立的PRA体系检测限低至15.6copies/μL㊂图1　引物和探针筛选结果图2　特异性实验结果图3　灵敏性实验结果2.4　实际样品检测　将105拷贝的甲肝病毒加入2g毛蚶消化腺中,匀浆混匀后,进行提RNA㊁逆转录步骤,得到甲型肝炎病毒cDNA,分别用荧光PCR㊁荧光RPA方法检测,结果如下㊂表1　荧光PCR与荧光RPA检测实际样品结果检测方法样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品7样品8荧光PCR++++++++荧光RPA++++++++ 3　讨论 甲型肝炎是一种全球范围内较高发病率的消化道传染病,在人群中极易通过粪-口途径进行传播㊂由于甲型肝炎病毒抵抗力较强,在60℃的环境中,经过1h仍然不能完全被杀灭,在37℃的条件下用1∶4000的福尔马林,需要3h才能杀灭㊂因而甲型肝炎病毒排出体外后,可存活较长时间,通过污染水㊁食物是其主要的传播方式,毛蚶㊁草莓是其常见的传播介质〔10〕㊂因此及时检测发现被甲型肝炎病毒污染的水和食品,是切断甲型肝炎传播途径㊁防控疫情的重要环节㊂目前检测的国家标准是荧光定量PCR检测法,该方法特异性强㊁灵敏性高,但需要昂贵的仪器设备,耗时约1.5h,在现场检测和基层医疗单位难以推广使用㊂重组酶聚合酶扩增技术(RPA)不仅具有高灵敏性㊁高特异性的特点,并且对仪器设备要求低,在37-42℃条件下即可完成扩增,可通过便携式荧光检测仪㊁微流控芯片恒温扩增核酸分析仪在数分钟内报告结果㊂本研究通过设计甲型肝炎病毒特异性片段的RPA引物㊁探针,建立了基于荧光RPA技术的甲型肝炎病毒快速检测方法㊂引物筛选实验表明,RPA 反应4min时即可特异性扩增长度为200bp的目的片段㊂而PCR方法通常需要约1.5h完成扩增反应㊂特异性实验结果表明:本研究建立的RPA检测方法能够特异性地扩增甲型肝炎病毒基因组,不能扩增戊型肝炎病毒㊁诺如病毒㊁星状病毒基因组㊂灵敏性实验结果表明:本研究建立的荧光RPA检测方法可检测到低至15.6copies/μL的甲型肝炎病毒,可满足对水和食品的现场检测和临床样品检测㊂参考文献:〔1〕　VAUGHAN G,GONCALVES ROSSI L M,FORBI J C,et al.Hepatitis A virus:Host interactions,molecular epide⁃miology and evolution〔J〕.Infection,Genetics and Evolu⁃tion,2014,21:227.〔2〕　World Health Organization.Global hepatitis report,2017〔R〕.Geneva:WHO,2017.〔3〕　焦永真,韩剑秋,王宪明,等.1988年上海甲型肝炎暴发流行中从毛蚶分离到甲型肝炎病毒〔J〕.病毒学报,1990(4):312.〔4〕　毛群颖,高帆,卞莲莲,等.甲型肝炎疫苗的研发和应用〔J〕.中国生物制品学杂志,2017,30(9):999.〔5〕　RZE UTKA A,COOK N.Survival of human enteric viru⁃ses in the environment and food〔J〕.FEMS MicrobiologyReviews,2004,28(4):441.〔6〕　HIRNEISEN K A,BLACK E P,CASCARINO J L,et al.Vi⁃ral Inactivation in Foods:A Review of Traditional and No⁃vel Food‐Processing Technologies〔J〕.Comprehensivereviews in food science and food safety,2010,9(1):3.〔7〕　LILLIS L,LEHMAN D A,SIVERSON J B,et al.Cross-subtype detection of HIV-1using reverse transcriptionand recombinase polymerase amplification〔J〕.Journal ofVirological Methods,2016,230:28.〔8〕　XIA S,CHEN X.Single-copy sensitive,field-deploy⁃able,and simultaneous dual-gene detection of SARS-CoV-2RNA via modified RT–RPA〔J〕.Cell Discovery,2020,6(1):37.〔9〕　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,国家标准化管理委员会.贝类中甲型肝炎病毒检测方法:普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法:GB/T22287-2008〔S〕.北京:中国标准出版社,2008.〔10〕　BRUNI R,TAFFON S,EQUESTRE M,et al.Hepatitis a virus genotypes and strains from an endemic area of Eu⁃rope,Bulgaria2012–2014〔J〕.BMC Infectious Disea⁃ses,2017,17(1):497.(收稿日期:2020-05-04;修回日期:2020-09-20)。