收稿日期:2006-06-18 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270162);北京市自然科学基金资助项目(6032019) 作者简介:李拥军(1968-),男,副教授,博士。
*通讯作者用单胚mRNA 差显方法克隆羊早期胚胎发育阻滞形成的相关基因李拥军1,2,敖 红2*,孙桂金2,3 (1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009;2.中国农业科学院畜牧研究所,北京100094;3.山东农业大学动物科学与技术学院,山东泰安271018)摘要:为探讨山羊体外培养胚胎发育阻滞的发生机理,用单胚mR N A 差异显示技术,对来源于体内发育和体外培养的山羊早期8～16细胞期胚胎的基因表达进行了研究,获得体内发育胚胎特异表达的一些片段,并对其中1个片段进行了分析。
结果表明,该片段与犬信号肽酶复合体25亚基(SPC 25)基因具有92%的同源性。
SP C 蛋白可通过切除相关前体蛋白的信号肽,成为成熟的分泌蛋白而影响和作用于早期胚胎发育过程。
该基因可望对克服早期胚胎发育阻滞有重要作用。
关键词:单胚差显技术;山羊;胚胎;发育阻滞;基因中图分类号:S 814.8 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2007)05-0959-03Cloning of goat embryo development block related genes using single preim -plantation embryo mRNA differential displayLI Yong -jun 1,2,AO Hong 2*,SUN Gui-jin 2,3 (1.College of A nimal S cience and Technology , Yangz hou Univer sity ,Yangz hou ,J iangsu 225009,China ; 2.I nsitute of Animal S cience ,Chinese A cad em y o f A gricultural Science ,Beij ing 100094,China ;3.College of Animal S cience and T echnology ,S handong A gricultur al Univer sity ,Tai ′an ,S handong 271018,China ) Abstract :In or der to st udy the mechanism about the development blo ck o f go at pr eimplantatio n em br yo s ,the go at 8-16C stag e embry os o bt ained fr om in vivo and in vitr o was studied using t he w ay of sing le preimplantation embry o mRN A differ ent ial display.So me specific fra gments ex pressed in in vivo embry os w as found and one of them w as selected fo r furt her ana ly sis.T he r esult sugg est ed that this frag ment display ed hig h ho molog y (92%)t o do g signal peptidase co mplex 25000subunit (SP C 25)gene .M atur ed secret or y pro teins o bta ined w hen the sig nal peptides of its pr e-pr otesom e w er e cut o ut by SPC,and these secret or y pro teins rev ealed the functions on the em-br yo dev elopment.T her eby it is believed that the lack o f the gene ex pr ession o f SPC25may account fo r the devel-opment blo ck o f in vitr o pr oduced g oat implantation embry os . Key words :single pr eimplantatio n embr yo mRN A differential display ;g oat ;embry o ;dev elo pment block ;gene *Corr esp onding author 哺乳动物的卵母细胞,在生长和成熟的过程中,积累了一套控制胚胎早期发育的母型RNA 和蛋白质。
受精以后,雌、雄基因组结合构成合子基因组(Zygo tic g eneome)。
早期胚胎的发育,初始是受母型基因组(M aternal genome)控制的。
随着发育的进展,母型调控能力逐渐减弱,合子基因组控制发育过程开始,即转为合子型调控(Zyg otic regulatio n )。
由母型调控向合子型调控的转变,必须经过合子型基因激活过程(Zy gotic gene activation,ZGA),在经过一段时间两者皆起作用的调控过渡阶段,母型调控能力减弱直至消失,最终完全由合子基因组控制各个部分和各个发育阶段的发展。
在此过渡期间,胚胎经历着细胞水平和分子水平上的一系列复杂的变化。
如果不能顺利实现此过渡,则出现发育阻滞(Blo ck o f development ),即早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程,而在某个特定的发育时期停顿。
早期胚胎发育阻滞的时间因物种而不同,但往往与发育调控过渡的时间相关联。
山羊、绵羊都发生在早期的8～16细胞期胚胎。
这种发育阻滞在离体培养哺乳动物(包括人)着床前的早期胚胎较为普遍。
动物早期胚胎发育阻滞的分子机理一直是人们关注和研究的热点。
据此,本研究运用改进的单胚m RNA差异显示技术[1],对体内发育和体外培养获得的山羊早期发育的8～16细胞期胚胎进行分析研究,寻找两者在发育过程中在分子水平上所表现出的差异,以探讨体外培养的山羊早期胚胎发育阻滞的分子机理。
1 材料与方法1.1 山羊胚胎 山羊体内发育的早期8～16细胞期胚胎,通过常规同期发情和超数排卵处理,经手术法获取。
体外培养的8～16细胞早期胚胎,为mSOFM(m odified synthetic oviduct fluid medium)体外培养体系下培养获得。
上述胚胎均由中国农业科学院畜牧所基因与细胞工程研究室制备。
1.2 主要试剂 R Nasin、pGEM-T Vector、EcoR Ⅰ、100bp DNA Ladder、T aq酶(Pro mega);DT T (Merck);DEPC(Sigma);NP-40(Fluka);One-Step RT Kit(Qiagen);X-Gal、IPTG(Geview);玻璃奶回收Kit、质粒提取Kit、感受态快速制备Kit (博大泰克);3′锚定引物5′-AAGCTT T TT TT TT-TT T TT TG-3′和5′随机引物5′-AAGCT TT G-GT CAG-3′(上海生工)。
1.3 胚胎的处理 不同处理方法获得的体内、体外山羊早期发育8～16细胞期胚胎,用酸性台氏液(pH2.0～2.5)去除透明带,PBS清洗胚胎,然后再将含有胚胎的0.5 L的PBS液加入到1.5 L的胚胎裂解液中(20mm ol/L DTT,0.5%NP-40, RNasin1U/ L),将胚胎置于液氮中速冻数秒,然后移至-80℃冰箱保存。
1.4 RT-PCR反应体系的建立 将胚胎从-80℃冰箱取出,65℃5m in,然后置于冰浴。
建立25 L 反应体系,其中含1×RT PCR Buffer,400 mo l/L dNT P M ix,Enzy me M ix,0.6 mol/L锚定引物, 0.6 mo l/L随机引物,RNasin40U/ L,加入上步处理的胚胎2.0 L,用无RNase-DNase水补足至25 L。
反应条件是:50℃30min(反转录);95℃15 min;94℃45s,40℃1m in,72℃1min,共40个循环;72℃10min。
设置阴性对照。
每一时期取3个胚胎同时独立操作。
1.5 银染、差异条带的回收及再扩增 RT-PCR 反应产物进行5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后切下目的条带,用煮沸法回收差异条带。
以回收产物作为模板,建立50 L的反应体系,进行2次扩增。
反应条件是:94℃10m in;94℃1min,40℃90s, 72℃90s,20次循环;72℃10min。
94℃10m in;94℃1m in,42℃90s,72℃90s,20次循环;72℃10min。
将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定,玻璃奶回收法进行回收。
1.6 克隆及序列分析 将回收后的PCR产物克隆到pGEM-T载体,然后热激转化感受态大肠杆菌JM109,随机选取1个白斑接入3mL含Amp的LB 液体培养基中,37℃振荡过夜,菌液提取质粒,酶切判断有无插入片段。
将条带单一且大小前后相符的片段进行测序。
对测序结果进行NCBI GenBank数据库同源性检索。
序列测定由上海博亚生物技术公司完成。
2 结果2.1 差异显示PCR结果 胚胎解冻后,进行RT-PCR反应,反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,进行银染显色。
首先通过对试验中阴性对照的检测,以验证总RNA中无DNA的污染,以确立所建立的技术体系的可靠性。
图1为部分体内、体外山羊早期8～16细胞期胚胎的电泳图谱。
用煮沸法对部分在体内发育胚胎表达,而在体外培养胚胎不表达或表达不显著的差异条带进行回收,以回收产物作为模板,经2次扩增后大都能获得特异性再扩增的条带,条带单一清晰,大小200～600bp(图2)。
本研究选择了其中1条特异表达的条带进行了后续分析(条带位置见图1所示),该条带经克隆、转化、酶切鉴定,显示有大小400～500bp的目的片段(图3)。
图1 山羊体内、体外8～16细胞期胚胎部分聚丙烯酰胺凝胶图谱 1～3、4～6.分别为体内发育和体外培养的8～16细胞胚胎;M.100bp分子量标准2.2 特异条带序列分析结果 对上述的克隆片段进行测序,测序结果用Blast软件经与GenBank中的EST 和NR 库中已有的序列进行对比,结果表明,该段序列与犬信号肽酶复合体25亚基(SPC25)基因具有92%的同源性(Scor e=228bits (115),Expect =8e -57,Identities =362/393(92%))。
