原位杂交

原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。

该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。

原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。

2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。

3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。

标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。

4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。

5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。

6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。

原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。

它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。

此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。

总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。

• 早期应用的主要是DNA探针 • Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了 cDNA探针（complementary DNA），其基 本原理是以RNA为模板，经逆转录酶 （reverse transcriptase）又称为RNA指 导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为 模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这 一途径与一般遗传信息流的方向相反，故 称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分 子。
• 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境， 又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。 • Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功。 • Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛 （DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原 性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。 • 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高， 应用不够普遍。
• 多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ ethanolamine）中以减低静电效应，减少 探针对组织的非特异性背景染色。 • 有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外， 还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预 杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。 • 但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并 不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH 的信/噪比例。
• Pezzella（1987）创建了用磺DNA探 针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺 基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克 隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 • 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺 口平移标记，敏感度也较高。 • 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立 的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测 了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化 物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞 中的定位。 • 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是 在病毒学和病理学的临床诊断中。

原位分子杂交原位杂交核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。

它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。

分子生物学技术中的杂交液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交菌落原位杂交Colony in situ hybridization斑点杂交Dot blotSouthern 印迹杂交Northern 印迹杂交原位杂交又称原位杂交组织化学依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子原位杂交原理变性(denaturation)---双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程复性(renaturation)---变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构退火◆杂交(hybridization)---不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起⏹探针(probe)---一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段◆靶核酸分子---所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA原位杂交基本原理利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分【原位杂交优点】☞既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性☞既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究☞所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本☞应用范围广探针及其制备探针的长度：以选择50～300bp最为适宜（一）探针的种类与制备根据标记方法不同，分为放射性探针和非放射性探针原位杂交的探针分子：cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针cDNA探针（complementary DNA）双链cDNA探针是最常用的核酸探针通常容易得到的cDNA探针是克隆于质粒载体中的特异cDNA分子【制备方法】用生物工程技术获取特异的cDNA片段从mRNA逆转录生成cDNA→构建cDNA 文库→筛选和克隆特异cDNA 分子特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组•质粒转化•质粒扩增•质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针【优点】1. cDNA探针不含内含子序列, 特别适用于基因表达的研究2. DNA探针一般较RNA探针敏感3. 克隆于质粒载体中, 使用方便, 不需再次克隆4. 多种标记方法, 可靠易行5. 杂交适宜温度范围较宽, 较稳定, 不易降解【缺点】1. 要用凝胶电泳移除载体序列2. 探针需变性3. 杂交反应中可能存在自身复性RNA探针---体外转录技术制得◆一类新型的载体: 噬菌体pSP和pGEM这类载体在多克隆位点的二侧分别带有SP6启动子和T7启动子, 在SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶作用下, 可以进行RNA转录◆将外源特异cDNA片段插入多克隆位点接头处→DNA重组体→转化细菌→质粒扩增→质粒抽提→体外转录合成RNA探针【优点】☞单链分子, 在组织内通透性好, 杂交效率比DNA探针高☞RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定☞通过改变外源DNA插入方向, 或选用不同的RNA聚合酶, 可转录出正义RNA链和反义RNA链反义RNA链---又称cRNA链, 用作杂交的探针正义RNA链---用于杂交的阴性对照☞杂交体所需解链温度高, 能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤【缺点】1. 容易受RNA酶污染2. 制备过程复杂3. 杂交适宜的温度范围较宽寡核苷酸探针根据靶核酸序列而设计, 在DNA合成仪上用化学方法合成的短链探针【优点】1.10~50bp, 在组织内通透性好2. 单链DNA寡核苷酸, 杂交时无需变性, 无自身杂交3. 一次合成, 可使用多时, 价格低廉4. 对RNase不敏感, 比RNA探针更稳定, 便于操作【缺点】1.与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定2. 探针较短, 所携带的标记物较少, 特异性、敏感性都低3.标记方法受限制, 只能采用末端标记法探针的标记1. 标记物理想的标记物应具备的条件:☞标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同☞标记后探针的检测方法要简便, 准确, 可靠, 重复性好☞安全无害目前常用标记物有同位素和非同位素二大类⏹同位素标记探针: 35S, 32P, 33P 和3H◆非同位素标记探针⏹生物素:生物素广泛的存在于动物体内内源性生物素对杂交信号的干扰地高辛:半抗原, 从洋地黄植物的花和叶中提取杂交信/噪比高, 敏感性高非同位素标记物中的最佳选择2.标记方法⏹(1) 双链cDNA探针的标记随机引物法(random primed DNA labelling)⏹(2) RNA探针标记---在体外转录技术中与探针制备同时完成(3) 寡核苷酸探针标记---主要是末端标记法(end-labelling )标记探针的纯化与检验纯化: 将标记反应中未被结合的,即游离的标记dNTP,与掺入cDNA或cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的部分去除纯化的方法:普通凝胶柱层析, 离心凝胶层析, 乙醇沉淀法检验:斑点印迹法，液闪法原位杂交方法(一) 探针及其标记(二) 组织样品制备1. 去除或抑制RNA酶物理方法: 1. 对耐高温的实验器具高温烘烤180℃3小时以上2. 实验用试剂, 耐热塑料器具120℃30min化学方法: 杂交用试剂均应用DEPC水配制对不耐热的器具可浸于DEPC水中, 室温处理2~3h实验中注意戴口罩和手套操作DEPC---焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)通过与组氨酸结合而使蛋白质变性配制: 0.1%DEPC水37℃水浴恒温振荡过夜2.取材及固定◆取材：组织要求新鲜如有可能尽量使用灌流固定手术材料最好在组织离体后30min内取材并立即进行固定取材过程中防止RNA酶的污染固定1. 目的：避免组织细胞中核酸的降解，保存组织细胞形态结构的完整2. 固定方法: 灌流法, 浸泡法浸泡法: 一般将组织块切成0.5~1.0cm3大小, 浸泡于15倍左右体积的固定液中, 固定24hr冰冻切片或细胞培养标本, 固定20~30min3.固定时间4.常用固定剂: 4%多聚甲醛, 10%甲醛包埋和切片石蜡包埋和切片方法同常规操作过程中防止RNA酶污染戴手套操作切片刀用DEPC水擦拭，镊子消毒后使用切片时，用0.1%DEPC水展片新鲜切片60℃烘烤16~24hr玻片的处理❑玻片上涂上粘附剂❑常用粘附剂: APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)多聚赖氨酸明胶❑防脱处理后高温消毒原位杂交实验1.杂交前处理目的:提高组织的通透性，增加靶核酸分子的可及性常用方法:脱蜡，去污剂，表面活性剂：Triton X-100，SDS，Tween蛋白酶：蛋白酶K，胃蛋白酶2.预杂交: 将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育3. 探针和靶核酸的变性杂交滴加含有探针的杂交液(20μl/片), 盖上盖玻片或无菌的石蜡膜, 置于湿盒内, 在合适温度的烘箱内杂交❑杂交液钠盐: 5 X SSC (标准柠檬酸钠-氯化钠溶液)50%去离子甲酰胺硫酸葡聚糖牛血清白蛋白, 鲑鱼精DNA等❑探针浓度放射性标记探针---0.5ng/μl非放射性标记探针---2ng/μl⏹PH值: 通常使用缓冲液PH7.2~7.4❑杂交温度: 一般低于相应杂交体的Tm值25℃❑杂交时间❑杂交环境: 湿盒内加少量与杂交液相同渗透压的SSC (5X SSC)杂交后漂洗在高严格度条件下，漂洗除去未参与杂交体形成的过剩探针，消除探针与组织细胞的非特异结合高严格度条件：指高的温度，低的钠离子浓度一般用浓度递减的SSC溶液在一定温度和振荡下漂洗切片：2X SSC→1X SSC→0.5X SSC杂交后信号检测❑同位素标记探针: 放射自显影❑DIG标记探针:AKP或HRP标记的抗DIG抗体显示系统DIG-AKP检测系统: 以NBT/BCIP为底物显色, 结果为紫蓝色沉淀DIG-HRP检测系统: 以DAB/H2O2为底物, 结果为棕阴性对照试验方法作用●杂交前用核酸酶处理如果杂交信号明显降低或消失, 说明探针是与组织细胞中●的核酸杂交●杂交液中省去探针如果出现阳性反应, 说明这些信号是与杂交反应无关的●用正义核酸探针如果无杂交信号, 表明探针的特异性●加过量未标记探针杂交后阻断标记探针与待测核酸的结合, 如杂交再加标记探针杂交信号消失或下降, 表明探针杂交的特异性5. Northern或Southern分析如果在待测核酸的分子量大小处显示一条杂交信号带, 表明探针的特异性6. 将标记探针与未标记探针按如果杂交信号随标记探针量的增加而增一定比例混合, 然后杂交加, 说明探针是特异的实验中可能出现的问题原位杂交实验失败1. 探针探针的敏感性;保存的好坏, 保存时间探针浓度; 探针长度2.组织材料的保存3. 实验过程中防止RNase污染, 做到严格的无RNase操4. 杂交前处理:蛋白酶消化的浓度, 时间PK在冰冻切片浓度为0.5~2μg/ml石蜡切片浓度10~20μg/ml5. 杂交条件: 温度时间6. 杂交体检测脱片☞玻片的防脱处理☞杂交前预处理时蛋白酶的浓度，消化时间☞杂交后漂洗过度非特异性染色☞探针特异性不高☞组织细胞内内源性酶染色内源性过氧化物酶0.5%~5%H2O2内源性碱性磷酸酶1mmol/L左旋咪唑内源性生物素☞杂交后的漂洗2X SSC→1X SSC→0.5X SSC37℃振荡漂洗⏹ 概念：⏹ 原位杂交 ，变性，复性（退火），探针，靶核酸分子 ⏹ 原位杂交基本原理，优点⏹ 探针的种类及优缺点⏹ 探针的标记方法及原理⏹ 组织样品制备时的注意事项⏹原位杂交中可能会出现哪些问题，应怎样避免这些问题⏹原位杂交特性以及与免疫组化比较⏹。

原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。

其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。

原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。

这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。

该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。

但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。

我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。

整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。